Способ подбора электропроводности буфера и установка для его осуществления

Способ подбора электропроводности буфера и установка для его осуществления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскик

Социелистическик

Республик (6! ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 070378 (21) 2588058/23-26 с присоединением заявки Hо

Государственный коиитет

СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 15 05 80 Бюллетень ИР 18

Дата опубликования описания 15.05.80 (72) Авторы изобретения

В.A,×åêàíoâ и И,С.Габуев (7!) Заявитель

Институт биологической физики Академии наук СССР (5 4) СПОСОБ ПОДБОРА ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТИ БУФЕРА

И УСТАНОВКА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к технике разделения электрофорезом смеси веществ или дисперсных частиц и, может быть использовано в исследованиях по молекулярной и клеточной биологии, в медицичских исследованиях для разделения клеток крови.

Известен способ подбора электропроводности буфера для электрофореза, заключающийся в том, что текущий слой!0 буфера с введенной в него струей разделяемой смеси подвергают воздействию постоянного электрического поля при различных удельных электропроводностях буфера, анализируют полу- !5 ченные фракции по составу и затем выбирают для применения электропроводность буфера, которая дает наилучшее разрешение (1). Устройство для осуществления способа содержит 20 проточную электрофоретическую камеру, электроды, инжектор для ввода разделяемой смеси, емкость для буфера, насос для подачи буфера в проточную камеру, источник постоянного напря- 25 жения, Недостатком описанного способа является большая ллительность подбОра (3-4 часа), вызываемая необходи- 30 мостью многократного разделения смесн и последующего анализа фракций.

Целью настоящего изобретения является увеличение скорости подбора электропроводности буфера, Указанная цель достигается тем, что струю разделяемой смеси вводят в текущий слой буфера с удельной элект. ропроводнбстью 10"" -2 ° 10 ц ом см" затем подвергают слой воздействию переменного электрического поля непрерывно добавляя в текущий слой буфер с удельной электропроводностью

10 -2;10 ом см до получения удельной электропроводности буфера, при которой диаметр струи разделяемой смеси при наложении поля равен ее диаметру без воздействия поля.

При этом получают удельную электропроводность буфера с максимально разрешающей способностью.

Подбор проводят в интервале параметров: напряженности электрического поля 40-60 в/см, скорости протока слоя буфера 0,5-1 см/сек, толщине слоя, буфера 0 5-1 mn, диаметра струи смеси 0,1-0,2 мм, температуре буфера 10-20 С. Эти параметры соответствуют тем, которые используют при электрофорезе в свободной среде.

734310

Длину области воздействия поля выбирают н интервале 10-15 см, что обеспечивает: во-первых, регистрацию в процессе подбора расширения струи смеси при недостаточной электропроводности текущего слоя; во-вторых, при этом изменение температуры слоя по

5 длине вследствие выделения джоулева тепла не превйшает 2-3 С и при скоростях протока 0,5-1 см/сек не требуется охлаждение слоя для подавления тепловой коннекции. 1Î

Ширину слоя буфера выбирают в ийтервале 1-3 см, чтобы. исключить расширение,струи смеси, обусловленное параболическим профилем скорости потока по ширине слоя. Применяют 15 переменное электрическое поле с частстой 0,5-1 кгц, чтобы исключить дополнительное расширение струи смеси, вызываемое электроосмотическим движением буфера на границах слоя. 2О

Для подбора электропронодности буфер 1 используют текущий буфер с

К =10 -2 ° 10 ом см, т.е. в 5-М -1 -4

10 раз меньше удельной электропроводности обычно используемой для электрофореза, т.к. максимальное разрешение может быть достигнуто и при значительно меньшей электропроводности, В качестве добавки применяют буфер с К 410 -2 ° 10 ом см, чтобы добавление его в процессе подбЬра в текущий слой не изменяло скорости течения более чем на 5-10%, при этом не требуется средств поддержания постоянной скорости течения ,слоя ., разделяемую смесь объемной концентрации 3-10% суспензируют или растворяют в буфере с удельной электропроводностью К =10 -2 10 - ом см который обычно применяют при электро- 40

Форезе. В случае клеточных смЕсей буфер с удельной электропроводностью

К =10 "-2;10 ом см 1 и буфер .с

КЗ- — 10 -2 ° 10 ом см добавляют для

»з -з изотоничности сахарозу или глюкозу до концентрации 7-10%.

Указанная .цель достигается также тем, что в установке перед проточной камерой устанонлена смесительная камера, соединенная с емкостями для буферов, электроды присоединены к генератору переменного напряжения, а в нижней части проточной камеры установлен микроскоп.

На фиг. 1 представлен общий вид устанонки. установка содержит емкость 55

1 для буфера с К =10 -2 ° 10 ом см насос для его подачи 2, смесительную. камеру 3, емкость 4 для буфера с K =10 -2.10" оМ cM, насос для его подачи 5, проточную камеру б с фф электродами 7, генератор переменного напряжения 8, инжектор для ввода. разделяемой смеси 9, микроскоп 10, Пример. Проводился подбор электропроводности для разделения .д смеси нативных и фиксированных формалином эритроцитов кролика в Фосфатцитратном буфере с рН 7,2. Использовали удельйые электропронодности К =10 ом см, K =2 ° 10 ом см

К =10 ом см . В буфер с К, добав о ляли 103 сахарозы и в буфер с К

8% сахарозы и смесь равных объемов нативных и фиксированных эритроцитов до концентрации 5%. Подбдр проводили в переменном электрическом поле с частотой 0,5 кгц.и напряженностью

50 в/см при толщине слоя буфера 1 мм, ширине слоя 2 см и длине области воздействия поля 10 см и температуре буфера 20 С, Из емкости 1 буфер с К, =10 ом-1 см вводили насосом 2 со скоростью б мл/мин в смесительную каме-. ру 3, а из нее в проточную камеру б.

Через инжектор 9 вводили в камеру б струю смеси, измеряли микроскопом 10 в нижней части камеры б диаметр струи смеси, который был равен 0,14 мм. От генератора 8 подавали на электроды . 7 переменное напряжение, при этом диаметр струи смеси в нижней части камеры б увеличился до 2 мм. Непрерывно добавляя в смесительную камеру 3 насосом 5 буфер с К =10 ом см

Z из емкости 4 регулировали скорость

его поступления н смесительную камеру 3 до получения исходного значения диаметра струи 0,14 мм в нижней части камеры б. При этом расход буфера с К =,10 ом см составлял 0,5мг/мин, а удельная электропроводность буфера в камере б — K=1,55. 10 ом см1

Полученные результаты разделения показывают, что максимальное разрешение фракций достигается при удельной электропроводности буфера 1,55х х10 ом см 1

Предложенный способ и установка для его осуществления позволяют повысить скорость подбора электропро— водности буфера не менее, чем в 10 раз по сравнению с известным.

Формула изобретения

1. Способ подбора электропроводности буфера для разделения смеси неществ электрофорезом н свободной среде путем введения струи разделяемой смеси s текущий слой буфера при воздействии электрического поля, отличающийся тем, что, с целью ускорения подбора, струю разделяемой смеси вводят в текущий слой буфера с удельной электропроводностью 10 -2 10 oM i см, затем подвергают слой воздействию переменного электрического поля непрерывно добавляя в текущий слой буфер с удельной электропроводностью 10

-2 10 ом см до получения удельной электропроводности буфера, при

734310

Составитель Т.Барабащ редактор И, Потапова Техред А.Щепанская . Еорректор 10 абакар

Заказ 2014/37 . Тираж 698 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР

IIo делам изобретений H открытий

113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r.óæãîðîä, ул.Проектная,4 которой диаметр струи разделяемой смеси при наложении поля равен ее диаметру без воздействия поля.

2, Установка для осуществления способа по п,1, включающая проточную камеру, электроды, инжектор для ввода разделяемой смеси, емкость для буФера, насос для подачи буфера в проточную:камеру,,о т л и ч а ю щ ая с я тем, что,перед проточной камерой установлена смесительная камера, соединенная с емкостями для буферов. электроды присоединены к генератору переменного напряжения, а в нижней части проточной камеры установлен микроскоп.

Источники информацииi принятые во внимание при экспертизе

1. К.Rannig, 1969, ЯЬ. Progress

in separation and Ipurefication I

v.2, t.Gerritsen (Ed) N.J.London>

Уп егесХепсе, р.45 (прототип).