Способ получения пуллулана
Иллюстрации
Показать всеРеферат
Союз Советски»
Социо алмстммесюа
Рес ублмк (ti; 7351 77 и и
1 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 9 10.72 (21) 1834802/28-13 (5lj М. Кл. (23) Приоритет 1!,10.73 (32} 79413
С 12 О 13/04 (331 Янония
Гаеударотеенамй комитет
СССР оо делам азооретеиий н открмтий (3!)— (53) УДК 663.1 (088.8) Опубликовано 15 05 80. Бюллетень Ие 18
Дата опубликования описании 1505.80
Иностранцы
Косо Като и Макото Сиесака (Япония) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма
"Хаясибара Биокемикал Лабораториэ инкорпорейтед" (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУЛЛУЛАНА
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а иметйо к получению полисахарида пуллулана путем аэробной микробной ферментации.
Известен способ получения пуллулана путем б вырашивания пуллулан-синтезирующих микроор. ганиэмов в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, небольйие количества необходимых для роста питательных веществ, с последующим иэвлече- lð нием пуллулана иэ культуральной жидкости.
Однако выход продукта в известном способе довольно низкий. .С целью повьппения выхода продукта предложено в качестве источника углерода приме- 15 нять крахмальный гидролизат, имеющий декстрозный эквивалент (Д3) 20-70, преимущественно
35-60.
В этом случае крахмальный гидролизат состоит в основном из олигосахаридов. Целесооб- Я разно кон1тентрацию поддерживать гидролизата в питательной среде 5 и 15 вес.%.
Рекомендовано применять следующие микроорганизмы: Pullularia fermentans чат fermen—
tens lFO 6401, Pullularia fermentans чаг. fusca .
IFO 6402, Pullularia pullulans AHU 9553, Pullu—
Iaria pul1uIans IPO 6353 или Dematium pullu—
lans lFO 4464.
Для ферментации пуллулана можно использовать крахмал, полученный из различных источников: кукурузы, пшеницы, картофеля и цр.
Если используемое сырье только частично состоит из крахмала, например рисовая мука, рисовые, отруби, овсяная крупа, его обрабатывают й- амилазой при 50-70 С и отфильтровывают полученный водный раствор для удаления нерастворимого материала.
Сироп гндролизованного крахмала, необходимый для ферментации, можно получить с помощью кислотного или ферментативного гидролиза. Гидролиз необходимо проводить таким образом, чтобы избежать образование продукта, имеющего ДЭ ниже "О, который может содержать непрореагировавший декстрин.
Д гя проведения кислотного гидролиза к взвеси крахмала в впде цобавлянтг щавелевую или соляную кислоту go pl1 2 или ниже, смесь
77 4 вать содержащийся в ней фермент. Микробные клетки удаляют центрифугирова кием, К жидкости, освобожденной от клеток, добавляют метанол или другой органический растворитель, хорошо растворимый в воде и не растворяющий пуллулан, в количестве, достаточном для осаждения пуллулана.
Осажденный пуллулан извлекают иэ жидкости и очищают повторным растворением в воде и осаждением органическим растворителем, Очищенный пуллулан представляет собой беловатый порошок, который очень легко растворяется в воде с образованием вязкого раствора.
Средняя степень полимеризации пуллулона, полученного данным способом, приблизительно
1000-3000.
Пример 1. Dematium pullulens fFO4464 выращивают в среде, содержащей 10% источника углерода, 0,2% пепгона, по 0,2% КэНРО4 и NaCI, 0,04% М98047 Нэ О и 0 001% Fe 804 7Нэ О.
В качестве источника углерода добавляют глю. козу, сахарозу, мальтозу (ДЗ 60,5), кислотный гидролизат крахмала (ДЭ 45) и ферментативный гидролизат крахмала с ДЭ 40. Начальный рН сре- ;цы 7,5.
Кислотный гндролиз и комбинация кислотного и ферментативного гидролиэа обеспечивает получение крахмального сиропа, имеющего
ДТЭ 50 или выше, ДЭ гидролиза, полученного только обработкой а-амилазы, не бывает выше
35.
Питательная .среда должна содержать другие вещества, необходимые для роста микроорганиз- мов, такие как органические или неорганические источники азота, неорганические соли, например фосфат калия, натрий хлористый, маг- ний сернокислый, железо сернокислое "и тд.
Начальный рН культуральной среды должен бь "ть 5-7,5, температура ферментации 27-30 С.
Самая высокая концентрация пуллулана обычно достигается через 3-8 сут, когда в среде не остается; остаточйого сахара.
Степень полимеризации пуллулана имеет тенденцию к уменьшению с увеличением времени ферментации, поэтому если требуется продукт с высоким молекулярным весом, ферментацию
36 прерывают до достижения более высокого выхода продукта.
Аэрирование культуры осуществляют обычным способом, Условия аэрации не оказывают осущественного влияния на выход продукта..
После окончания ферментации культураль-
Hagio жидкость прогревают, чтобы инактивироТаблица 1
Показатель
Выход продукта, o
Источник углерода в среде сахар в среде, r/100 мл среды рН через сут через сут
1Л
Ll
5,8 3,2 .0,5
21 32 43
0,8
1,4 5,1 1,2 0,3
2,0 . 6,5 3,1 0,5
4,2 4,2
30 45 54
4,2 4,6
Мальтоэа %"
0,97
10 32 61
3 7351 выдерживают прн 120 С до тех пор, пока не получится требуемый ДЭ.
Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют карбонатом кальция и/или натрия, обесцвечивают активированным углем и очищают or посторонних ионов. с помощью ионообменной смолы.
Обесцвеченную жидкость можно использовать для приготовления питательной среды.
Крахмальный гидролизат можно также полу- 10 чить обработкой только а -амилазой или комбинациои кислотного и ферментативного гидроли за.
Выращивание осуществляют в колбах емкостью 500 мл, содержащих 100 мл среды, на круговой качалке при 27 С в течение 7 сут. Пробы отбирают через 3,5 и 7 сут и центрифугируют.
K освобожденной от клеток культуральной жидкости добавляют 3 объема метанола для осаждения полисахарида, который очищают дважды растворением в небольшом количестве воды и переосаждением метанолом.
Собранные осадки промывают метанолом, высушивают и взвешивают.
Осадки идентифицированы как пуллулан пщролизом их пуллуланазой и бумажной хроматографией гидролизатов.
Результаты представлены в табл. 1.
735177
Процолжение табл. 1
Выход продукта, % рез сут
Кислотный гидр опизат крахмала (ДЗ 45) 4,2 4,4 0,9 1,9 5,5. 1,8 0,1 . 38 67 75
Ферме нтативный гидролизат крахмала (ДЭ 40) 1,8 5 1 2,0 0,3 35 65 72
4,2 4,2 0,9
Пример 2. Pullularia pullulans AHU 9693 выращивают в условиях, описанных в примере 1, на средах, содержащих глюкозу, сахарозу, мальтозу 5 крахмал, гидролиэованный в два этапа: кислотой и ферментативно до ДЭ 46 и крахмал, гидролиэованный кислотой до ДЭ 43. В табл. 2 приведены значения остаточнбго сахара и выходы пуллулана на разных средах.
Та блица 2
Выход пуллулана, %
Остаточный сахар, г/100 мл
Источник углерода в среде
1,7 г люкоза
Сахароз а
Мальтоза
Крахмал, гидролизованный в два этапа (ДЭ 46) 63
0,8
Крахмал, гидролизованный кислотой до ДЭ 43
0,5
Полученный пуллулан слегка окрашен.
11 р и м е р 3. Pullularia pullulans @08363 в примере 1, содержащей 15% кислотного гидровыращивают в условиях и на средах, описанных лизата крахмала с ДЭ 35. в качестве единствен50 в примере 1, но длительность ферментации ного источника углерода.
5 сут. Выходы пуллулана ниже, чем в примере 1, После ферментации в течение 8 сут яа .сачало так как продолжительность ферментации меньше, . ке при 27 С, когда в .среде не содержалось остано на среде с гидролизатом крахмала пуллулана точных сахаров, фермент инактивируют прогресинтезировано на 25-30% больше, чем на среде валяем
S5 с сахарозой или глюкозой. Клетки удаляют, пуллулан осаждают иэ бесПример 4. Pullularia pullulans var. клеточной жидкости добавлением трех объемов
fuses IFO 6402 выращивают в среде, описанной метанола. Осадок отделяют и очищают повторным
7 73517 растворением в воде и переосахсдением метано лом.
10%-ный водный раствор очищенного пуллулана обрабатывают пуллуланазой, выделенной вз культуральной жидкости Aегоbacter, затем обесцвечивают активированным углем, очищают
m ионов ионообменной смолой и частично упариваю до получения бесцветного сиропа, По результатам хроматографичсского анализа и определения восстановительной способности 1о продукт содержит чистуто мальтотриозу.
Выход мальтотриозы 95%, 30%-ный водный раствор мальтотриоэы помещают в автоклав с 0,30% карбоната кальция и
10% никеля Ренея, осажденного на твердых частицах, присутствующих в растворе.
Мальтотриозу подвергают гидрированию при
100 С и давлении водорода 100 кг/см . Прогидрированную смесь профильтровывают для удаления катализатора, фильтрат обесцвечивают
20 и очищают от примесных ионов, как описано вьппе.
Бесщ етии жидкость не обладает восстановительной способностью и при гидролизе дает
25 глюкозу и сорбит в .молярном соотношении
2:1.
Таким образсм, продукт гидрирования— мальтотритол. Получен из мальтотриозы с выходом 96%.
Ниже приведена характеристика штаммов.
Pullularia fermentans наг fermentans IFO
6401.
Бластоспоры 3-4 на 7-10 мкм, хламидоспорьг
13-15 мкм, артроспоры 5-7 на 10-15 мкм, кладоспорные образования 9-17 мкм.
Черные колонии с белым поверхностным мицелием на кукурузном агаре и агаре Сабурода.
Пигмент образует только в аэробных условиях периодически на среде Литтмана и не образует на . питательном агаре.
Воздушный мицелий образует периодически.
При 37 С не растет.
Сбраживает глюкозу, манноэу, фруктозу, мальтозу, сахарозу и рафинозу.
Puflularia fermentans var. fusee IFO 6402, Бластоспоры 3-4 на 11-13 .мкм, хламидоспоры 13-16 мкм, артроспоры 3-6 на 8-12 мкм, кладоспорные образования 4-6 на 14 мкм.
Черные мукоидные колонии с черным поверхностным мицелием на кукурузном агаре, ага 0 ре Сабурода и Литтмана.
Пигмент периодический в анаэробных условиях, иа питательном агарс отсутствует.
Воздушный мицелий не образует. При 37Ъ
55 растет. Сбраживает гликсэу, манноэу, фруктозу, 5мальтозу, сахарозу, рафинозу и ксилозу. Кольца пелликлов были найдены в растворе.
Pullularia pullulans АНИ 9593.
7 8
Бластоспоры 3-4 на 7-11 мкм, хламидоспо- ры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7-10 мкм, кладоспорные образования 3-5 на 12-14 мкм.
Маленькие черные колонии с эеленоваточерной поверхностью и воэду пный мнцелий на кукурузном arape, агаре Сабурода и Литтмана.
Пигмент образует только в анаэробных условиях. Растет при.37 С. Пелликлы в растворе были найдены со слабым осадком.
Углеводы не сбраживает.
Pullularia pul1ulans tFO 6353.
Бластоспоры 3-4 на 7-11 мкм, хламидоспоры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7-10 мкм, кладоспорные образования 3-5 на 12-14 мкм.
Маленькие черные колонии с зеленоваточерной поверхностью и воздушный мицелий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана, Пигмент образует только в анаэробных условиях, Растет при 37 С. Пелликлы в растворе были найдены со слабым осадком, Углеводы не сбраживает.
Dematium pullulans IF(3 04464.
Бластоспоры 3-4 на 8-12 мкм, хламидоспоры
8-10 на 14-18 мкм, артроспоры 2-3 на 3-5 мкм.
Маленькие черные колонии с зеленовато-черной поверхностью и воздушный мицелий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана.
Пигмент образует только в анаэробных условиях.
Растет при 37 С.
Углеводы не сбраживает.
Формула изобретения
1. Способ получения пуллулана путем выращивания пуллулан-синтезирующих микроорганизмов в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим извлечением пуллулана иэ культуральной жидкости, о т л ич а ю шийся тем; что, с целью повышения выхода продукта, в качестве источника углерода применяют крахмальный гидролизат, имеющий декстрозный эквивалент 20-70, преимущественно
35-60.
2. Способ по п,1, отличающийся тем, что применяют крахмальный гидролизат, в основном состоящий из олигосахаридов.
3, Способ по п.1, отличающийся тем„что концентрацию крахмального гидролиэата в питательной среде поддерживают в диапазоне 5-15 вес.%.
4. Способ по пп.1 -3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма применяют штамм
Pullularia fermentans var. fermentans IFO 6401.
Составитель Л. Минеева
Техред Л.Тесл юк Корректор Н.Степ
Редактор Н. Потапова
Заказ 2120/58 Тираж 522 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
9 735177 10
5. Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю щ и й- 7, Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующе- с я тем, что в качестве пуллулан-синтезируюго микроорганизма применяют штамм Pul luis — щего микооорганизма применяют штамм Pull uâ€
ria fermentans var. fusee IFO 6402. Iaria pullulans .IFO 6353.
6. Способ по пп.1-3, î r л и ч а ю щ и и - 8. Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве пуллулан-синтезирую- с я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма применяют штамм Put lu — щего микроорганизма применяют штамм DemaIaria pulIuIans АИИ 9593. tIum pullulans IFO 4464.