Способ получения пуллулана

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советски»

Социо алмстммесюа

Рес ублмк (ti; 7351 77 и и

1 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 9 10.72 (21) 1834802/28-13 (5lj М. Кл. (23) Приоритет 1!,10.73 (32} 79413

С 12 О 13/04 (331 Янония

Гаеударотеенамй комитет

СССР оо делам азооретеиий н открмтий (3!)— (53) УДК 663.1 (088.8) Опубликовано 15 05 80. Бюллетень Ие 18

Дата опубликования описании 1505.80

Иностранцы

Косо Като и Макото Сиесака (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Хаясибара Биокемикал Лабораториэ инкорпорейтед" (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУЛЛУЛАНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а иметйо к получению полисахарида пуллулана путем аэробной микробной ферментации.

Известен способ получения пуллулана путем б вырашивания пуллулан-синтезирующих микроор. ганиэмов в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, небольйие количества необходимых для роста питательных веществ, с последующим иэвлече- lð нием пуллулана иэ культуральной жидкости.

Однако выход продукта в известном способе довольно низкий. .С целью повьппения выхода продукта предложено в качестве источника углерода приме- 15 нять крахмальный гидролизат, имеющий декстрозный эквивалент (Д3) 20-70, преимущественно

35-60.

В этом случае крахмальный гидролизат состоит в основном из олигосахаридов. Целесооб- Я разно кон1тентрацию поддерживать гидролизата в питательной среде 5 и 15 вес.%.

Рекомендовано применять следующие микроорганизмы: Pullularia fermentans чат fermen—

tens lFO 6401, Pullularia fermentans чаг. fusca .

IFO 6402, Pullularia pullulans AHU 9553, Pullu—

Iaria pul1uIans IPO 6353 или Dematium pullu—

lans lFO 4464.

Для ферментации пуллулана можно использовать крахмал, полученный из различных источников: кукурузы, пшеницы, картофеля и цр.

Если используемое сырье только частично состоит из крахмала, например рисовая мука, рисовые, отруби, овсяная крупа, его обрабатывают й- амилазой при 50-70 С и отфильтровывают полученный водный раствор для удаления нерастворимого материала.

Сироп гндролизованного крахмала, необходимый для ферментации, можно получить с помощью кислотного или ферментативного гидролиза. Гидролиз необходимо проводить таким образом, чтобы избежать образование продукта, имеющего ДЭ ниже "О, который может содержать непрореагировавший декстрин.

Д гя проведения кислотного гидролиза к взвеси крахмала в впде цобавлянтг щавелевую или соляную кислоту go pl1 2 или ниже, смесь

77 4 вать содержащийся в ней фермент. Микробные клетки удаляют центрифугирова кием, К жидкости, освобожденной от клеток, добавляют метанол или другой органический растворитель, хорошо растворимый в воде и не растворяющий пуллулан, в количестве, достаточном для осаждения пуллулана.

Осажденный пуллулан извлекают иэ жидкости и очищают повторным растворением в воде и осаждением органическим растворителем, Очищенный пуллулан представляет собой беловатый порошок, который очень легко растворяется в воде с образованием вязкого раствора.

Средняя степень полимеризации пуллулона, полученного данным способом, приблизительно

1000-3000.

Пример 1. Dematium pullulens fFO4464 выращивают в среде, содержащей 10% источника углерода, 0,2% пепгона, по 0,2% КэНРО4 и NaCI, 0,04% М98047 Нэ О и 0 001% Fe 804 7Нэ О.

В качестве источника углерода добавляют глю. козу, сахарозу, мальтозу (ДЗ 60,5), кислотный гидролизат крахмала (ДЭ 45) и ферментативный гидролизат крахмала с ДЭ 40. Начальный рН сре- ;цы 7,5.

Кислотный гндролиз и комбинация кислотного и ферментативного гидролиэа обеспечивает получение крахмального сиропа, имеющего

ДТЭ 50 или выше, ДЭ гидролиза, полученного только обработкой а-амилазы, не бывает выше

35.

Питательная .среда должна содержать другие вещества, необходимые для роста микроорганиз- мов, такие как органические или неорганические источники азота, неорганические соли, например фосфат калия, натрий хлористый, маг- ний сернокислый, железо сернокислое "и тд.

Начальный рН культуральной среды должен бь "ть 5-7,5, температура ферментации 27-30 С.

Самая высокая концентрация пуллулана обычно достигается через 3-8 сут, когда в среде не остается; остаточйого сахара.

Степень полимеризации пуллулана имеет тенденцию к уменьшению с увеличением времени ферментации, поэтому если требуется продукт с высоким молекулярным весом, ферментацию

36 прерывают до достижения более высокого выхода продукта.

Аэрирование культуры осуществляют обычным способом, Условия аэрации не оказывают осущественного влияния на выход продукта..

После окончания ферментации культураль-

Hagio жидкость прогревают, чтобы инактивироТаблица 1

Показатель

Выход продукта, o

Источник углерода в среде сахар в среде, r/100 мл среды рН через сут через сут

Ll

5,8 3,2 .0,5

21 32 43

0,8

1,4 5,1 1,2 0,3

2,0 . 6,5 3,1 0,5

4,2 4,2

30 45 54

4,2 4,6

Мальтоэа %"

0,97

10 32 61

3 7351 выдерживают прн 120 С до тех пор, пока не получится требуемый ДЭ.

Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют карбонатом кальция и/или натрия, обесцвечивают активированным углем и очищают or посторонних ионов. с помощью ионообменной смолы.

Обесцвеченную жидкость можно использовать для приготовления питательной среды.

Крахмальный гидролизат можно также полу- 10 чить обработкой только а -амилазой или комбинациои кислотного и ферментативного гидроли за.

Выращивание осуществляют в колбах емкостью 500 мл, содержащих 100 мл среды, на круговой качалке при 27 С в течение 7 сут. Пробы отбирают через 3,5 и 7 сут и центрифугируют.

K освобожденной от клеток культуральной жидкости добавляют 3 объема метанола для осаждения полисахарида, который очищают дважды растворением в небольшом количестве воды и переосаждением метанолом.

Собранные осадки промывают метанолом, высушивают и взвешивают.

Осадки идентифицированы как пуллулан пщролизом их пуллуланазой и бумажной хроматографией гидролизатов.

Результаты представлены в табл. 1.

735177

Процолжение табл. 1

Выход продукта, % рез сут

Кислотный гидр опизат крахмала (ДЗ 45) 4,2 4,4 0,9 1,9 5,5. 1,8 0,1 . 38 67 75

Ферме нтативный гидролизат крахмала (ДЭ 40) 1,8 5 1 2,0 0,3 35 65 72

4,2 4,2 0,9

Пример 2. Pullularia pullulans AHU 9693 выращивают в условиях, описанных в примере 1, на средах, содержащих глюкозу, сахарозу, мальтозу 5 крахмал, гидролиэованный в два этапа: кислотой и ферментативно до ДЭ 46 и крахмал, гидролиэованный кислотой до ДЭ 43. В табл. 2 приведены значения остаточнбго сахара и выходы пуллулана на разных средах.

Та блица 2

Выход пуллулана, %

Остаточный сахар, г/100 мл

Источник углерода в среде

1,7 г люкоза

Сахароз а

Мальтоза

Крахмал, гидролизованный в два этапа (ДЭ 46) 63

0,8

Крахмал, гидролизованный кислотой до ДЭ 43

0,5

Полученный пуллулан слегка окрашен.

11 р и м е р 3. Pullularia pullulans @08363 в примере 1, содержащей 15% кислотного гидровыращивают в условиях и на средах, описанных лизата крахмала с ДЭ 35. в качестве единствен50 в примере 1, но длительность ферментации ного источника углерода.

5 сут. Выходы пуллулана ниже, чем в примере 1, После ферментации в течение 8 сут яа .сачало так как продолжительность ферментации меньше, . ке при 27 С, когда в .среде не содержалось остано на среде с гидролизатом крахмала пуллулана точных сахаров, фермент инактивируют прогресинтезировано на 25-30% больше, чем на среде валяем

S5 с сахарозой или глюкозой. Клетки удаляют, пуллулан осаждают иэ бесПример 4. Pullularia pullulans var. клеточной жидкости добавлением трех объемов

fuses IFO 6402 выращивают в среде, описанной метанола. Осадок отделяют и очищают повторным

7 73517 растворением в воде и переосахсдением метано лом.

10%-ный водный раствор очищенного пуллулана обрабатывают пуллуланазой, выделенной вз культуральной жидкости Aегоbacter, затем обесцвечивают активированным углем, очищают

m ионов ионообменной смолой и частично упариваю до получения бесцветного сиропа, По результатам хроматографичсского анализа и определения восстановительной способности 1о продукт содержит чистуто мальтотриозу.

Выход мальтотриозы 95%, 30%-ный водный раствор мальтотриоэы помещают в автоклав с 0,30% карбоната кальция и

10% никеля Ренея, осажденного на твердых частицах, присутствующих в растворе.

Мальтотриозу подвергают гидрированию при

100 С и давлении водорода 100 кг/см . Прогидрированную смесь профильтровывают для удаления катализатора, фильтрат обесцвечивают

20 и очищают от примесных ионов, как описано вьппе.

Бесщ етии жидкость не обладает восстановительной способностью и при гидролизе дает

25 глюкозу и сорбит в .молярном соотношении

2:1.

Таким образсм, продукт гидрирования— мальтотритол. Получен из мальтотриозы с выходом 96%.

Ниже приведена характеристика штаммов.

Pullularia fermentans наг fermentans IFO

6401.

Бластоспоры 3-4 на 7-10 мкм, хламидоспорьг

13-15 мкм, артроспоры 5-7 на 10-15 мкм, кладоспорные образования 9-17 мкм.

Черные колонии с белым поверхностным мицелием на кукурузном агаре и агаре Сабурода.

Пигмент образует только в аэробных условиях периодически на среде Литтмана и не образует на . питательном агаре.

Воздушный мицелий образует периодически.

При 37 С не растет.

Сбраживает глюкозу, манноэу, фруктозу, мальтозу, сахарозу и рафинозу.

Puflularia fermentans var. fusee IFO 6402, Бластоспоры 3-4 на 11-13 .мкм, хламидоспоры 13-16 мкм, артроспоры 3-6 на 8-12 мкм, кладоспорные образования 4-6 на 14 мкм.

Черные мукоидные колонии с черным поверхностным мицелием на кукурузном агаре, ага 0 ре Сабурода и Литтмана.

Пигмент периодический в анаэробных условиях, иа питательном агарс отсутствует.

Воздушный мицелий не образует. При 37Ъ

55 растет. Сбраживает гликсэу, манноэу, фруктозу, 5мальтозу, сахарозу, рафинозу и ксилозу. Кольца пелликлов были найдены в растворе.

Pullularia pullulans АНИ 9593.

7 8

Бластоспоры 3-4 на 7-11 мкм, хламидоспо- ры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7-10 мкм, кладоспорные образования 3-5 на 12-14 мкм.

Маленькие черные колонии с эеленоваточерной поверхностью и воэду пный мнцелий на кукурузном arape, агаре Сабурода и Литтмана.

Пигмент образует только в анаэробных условиях. Растет при.37 С. Пелликлы в растворе были найдены со слабым осадком.

Углеводы не сбраживает.

Pullularia pul1ulans tFO 6353.

Бластоспоры 3-4 на 7-11 мкм, хламидоспоры 14 мкм, артроспоры 3-4 на 7-10 мкм, кладоспорные образования 3-5 на 12-14 мкм.

Маленькие черные колонии с зеленоваточерной поверхностью и воздушный мицелий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана, Пигмент образует только в анаэробных условиях, Растет при 37 С. Пелликлы в растворе были найдены со слабым осадком, Углеводы не сбраживает.

Dematium pullulans IF(3 04464.

Бластоспоры 3-4 на 8-12 мкм, хламидоспоры

8-10 на 14-18 мкм, артроспоры 2-3 на 3-5 мкм.

Маленькие черные колонии с зеленовато-черной поверхностью и воздушный мицелий на кукурузном агаре, агаре Сабурода и Литтмана.

Пигмент образует только в анаэробных условиях.

Растет при 37 С.

Углеводы не сбраживает.

Формула изобретения

1. Способ получения пуллулана путем выращивания пуллулан-синтезирующих микроорганизмов в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим извлечением пуллулана иэ культуральной жидкости, о т л ич а ю шийся тем; что, с целью повышения выхода продукта, в качестве источника углерода применяют крахмальный гидролизат, имеющий декстрозный эквивалент 20-70, преимущественно

35-60.

2. Способ по п,1, отличающийся тем, что применяют крахмальный гидролизат, в основном состоящий из олигосахаридов.

3, Способ по п.1, отличающийся тем„что концентрацию крахмального гидролиэата в питательной среде поддерживают в диапазоне 5-15 вес.%.

4. Способ по пп.1 -3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма применяют штамм

Pullularia fermentans var. fermentans IFO 6401.

Составитель Л. Минеева

Техред Л.Тесл юк Корректор Н.Степ

Редактор Н. Потапова

Заказ 2120/58 Тираж 522 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

9 735177 10

5. Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю щ и й- 7, Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующе- с я тем, что в качестве пуллулан-синтезируюго микроорганизма применяют штамм Pul luis — щего микооорганизма применяют штамм Pull uâ€

ria fermentans var. fusee IFO 6402. Iaria pullulans .IFO 6353.

6. Способ по пп.1-3, î r л и ч а ю щ и и - 8. Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве пуллулан-синтезирую- с я тем, что в качестве пуллулан-синтезирующего микроорганизма применяют штамм Put lu — щего микроорганизма применяют штамм DemaIaria pulIuIans АИИ 9593. tIum pullulans IFO 4464.