Способ получения иммобилизованной эндонуклеазы

Способ получения иммобилизованной эндонуклеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(72) Авторы изобретения

Л. П. Сенженко и В. К. Старостина

Специальное конструкторско-технологическое 6 биологически активных веществ (7!) Заявитель (S ) СПОСОБ ПОЛ ЧЕНИЯ ИММОВИЛЮОВАННОй

ЗН,ЧОНУКЛЕАЗЫ. SERRATE. A. AARCK SCE85

Изобретение относится к обпасти био технологии в частности к "пособам полу« чения иммобилнэованных ферментов, а именно к способу получения иммобилизованной эндонуклеазы Serra6a там сеасема и может использоваться в биохимии для гидролиза нуклеиновых кислот (ДНК и

PHK) в процессах получения олиго-. и

5" -мононуклеотидов. Использование этого препарата перспективно в медицине Nta лечения гнойных абсцессов и ран.

Известен способ подучения иммобвпизованных нуклеаэ, в котором нуклеазы ковалентно связывают е гидроксилсодержашими носителями активированными пред !

5 варительно бромистым цианом. В качестве носителя чаще всего применяется агаро-

Низкая механическая, термическая стой::. кости и сильное набухание в воде агарозы ограничивают область применения ферментного препарата в технологических процессах, а применение бромистого диана

2 для активации агарозы делает недопустимым использование этих препаратов в медицине, Наиболее близким по технической сущ; ности к изобретению является способ получения иммобилиэованной нуклеазы беетоМо щд*сво .ер, . Фермент ковалентно связывают с органическим гидроксилсодержашим полимером «м -аминобензипоксиметилдекстраном при помощи реакции диазосочетания. Активированный носитель попучают из коммерческого препарата декстрапа - полиглюкина с мол. весом 6QQQQ.

Способ иммобилизации фермента вюпочает обработку полиглюкина хлористым

4ь -нктробензилоксиметилпирндиниеьц выделение из цолученной смеси Ф -нитробензипоксиметилполиглюкина; восстановление последнего до Ф -аминобензилоксиметилполиглюкина; диализ, переосажденне и высушивание последнего; дназотирование, В аммнобензилоксиметклпойнглюки1Щ свя эыванне фермента с диаэотированным Маминобенэилоксиметилполиглюкином; отдеЗ 7355 ление иммобилизованной нуклеазы от непрореагировавшего попиглюкина при помощи гель-фильтрации.

Полученный ферментный препарат растО ворим в воде, при хранении при 12-15 C и рН 7,0 в течение двух месяцев сохраняет свою активность g2).

Однако, получение препаративиах количеств иммобилизованной эндонуклеазы изЬестным способом требует специальных МэтОДОВ ОЧИСТКИр таКИХ Ках ГЕЛЬ-фИХзТРа» ция и диализ. Способ трудоемок иэ-за многостадийности. Применение иммобильзОВаннОй эндонуклеазы g медицинских це пях предполагает использование высокоочишенного исходного фермента. Но даже в этом случае Возможность ее использования сомнительна„так как нет сведений об антигенных свойствах иммобилизованной нукпеазы. хо

При создании непрерывных технологических процессов получения олигорибо-, олигодезокси-рибо-5 --нуклеотидов и 5-моФ 1, НОнуклеОтидОВ с испОпьзованием растВОри мых ферментных препаратов возникает сложная задача отделения их от продуктов реакции.

Кроме того, данный способ иммобилизации эндонуклеазы Ье ч ба worc@все ь не и редставляет Возможность регулировать QHK-азную и PHK-amyl активности ферментного препарата, т.е. влиять на специфичность эндонуклеазы z одному из субстратов..

Бель изобретения - упрощение процесса йммобилизации, расшйрение. области применения иммобилизованной эндонуклеазы и увеличение специфичности эндонуклеазы к одному из субстратов.

4О

Указанная цель достигается за счет того, что процесс получения иммобилизованной эндонуклеазы проводят в присутст вии субстрата (PHK или ДНК) в качестве полимера используют аминоэтилцеллюлозу, предварительно активированную глутаровым альдегндом, причем Обычно количество используемого субстрат составляет

0,2-0,4 весА. Процесс Осуществляется следующим образом. я

Проводят активирование АЭ-целлюлозы

Водным раствором глутаровоГо альдегида.

Затем производят связывание фермента с активированной матрицей в присутствии субстратов (QHK или РНК) в концентра:ции не менее 2 мг/мл. Полученный препарат обрабатывают раствором ИОЬН .Стабилизированный таким Образом иммобили94

4 зованный препарат промывают солевым раствором.

Полученные препараты иммобипизованной эндонуклеазы обладают Высокой удельной активностью, около 14000 ед,/г матрицы. Препарат сохраняет 60% активности в течение года при хранении 5-10 С и о рН 7,0. При гидролизе PHK в проточной колонке в течение 15 дней ферментный препарат полностью сохраняет свою первоначальную активность, а при гидролизе

QHK в реакторе с перемешиванием за это же время активность препарата падает незначительно, на 10%.

Пример 1. К 50 г влажной

АЭ-целлюлозы добавляют 150 мл 25%-ного глутарового альдегида и 250 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение

2-х ч. Затем актнвированную АЭ-целлюлозу промывают О, — М раствором ИаЮ. К

50 г влажной активированной АЭ-целлюлозы добавляют 110 мп водного раствора . эндонуклеазы, содержащего 1740000 ед.акт. (за единицу эндонуклеазной активности принимают количество фермента, вызывающее увеличение поглощения кислоторастворимых продуктов при 260 нм на 1 о,е. за 20 мин при 37ОС; стандартное определение эндонуклеазной активности проводят по РНК) и 0,22 r ДНК. Реакционную смесь перемешивают при комнатной тем- пературе в течение 5 ч. Полученный препарат иммобилизованной эндонукпеазы отжимают на стеклянном фильтре и суспендируют в 500 мл 0,1%-ного раствора боогндрида натрия s 0,1 М Йа-Фосфатнам буфере (рН 8,0) в течение 30 мин при 6 С, Стабилизированный таким образом иммобилизованный фермент промывают 1 М раствором ИОИ. Препарат иммо:бнлизова нной андонуклеазы гидролизует как ДНК,так и РНК. Удельная активность препаратов, ед.акт/г сухой матрицы: PHKазы 7980; ДНК-азы 14140. Активность

QHK-азы в 1,8 раз превьнаает активность

РНК-азы. Выход по активности составляет 20%.

Пример 2. К 5 г влажной АЭцеллюлозы добавляют 15 мл 25%-ного глутарового альдегида и 25 мл дистиллированной воды, эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение

2-х ч. Затем активированную АЭ-.целлюлозу промывают 0,2 М раствором НОСО.К

5 г влажной активированной АЭ-.целлюлозы добавляют 2 4 мл ВОднОГО растВора эндонуклеазы, содержащего 580000 ед.

5 7355 акт. и 0,096 г т-РНК. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Полученный препарат иммобилизованной андонуклеазы отисимают на стеклянном фильтре и суспендируют в

50 мл 0,1%-ного раствора боргидрида натрия s 0 1 М М с фосфа тном буфере рН 8,0 в течение 30 мин при 6 С. Ста-лиэированный таким образом иммобилизованный фермент промывают 1 М раст- 10 вором КОСЮ, Препарат нммобилизованной эндонуклеазы гидролиэует как ДНК, так и PHK. Удельная активность препаратов, ед.акт/г сухой матрицы: РНК-азы 14063

ДНК-азы 7050. Активность PHK-азы в

2 раза превышает активность QHK-азы.

Выход по активности составляет 10%.

Как видно из примеров, связывание андонукпеаэы в присутствии одного иэ суб26 стратов приводит к избирательному новышению удельной активности по одному иэ субстратов в 1,5-2 раза. Это позволяет применять иммобилизованную эндонуклеазу для преимущественного гидролиза одного из субстратов (ДНК и РНК), если они оба содержатся в реакционной смеси.

К преимуществам водонерастворимой иммобилизованной эндонуклеазы относятся высокая стабильность, простота отде30 пения нерастворимого ферментного препарата от продуктов реакции, возможность многократного использования в периодических технологических процессах н длительного использования в непрерывных процессах для получения олигорнбо-, оли- 35 годеэокси-рибо-5 -нуклеотидов и 5 -мо1 1 нонуклеотидов. Кроме того, способ не требует высокоочищенного исходного фермен4 6 та, а нерастворимые производные нуклеаэ перспективны как фармацевтические препараты для местного лечения гнойных ран.

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованной эндонуклеазы 1ь гоМо юо е каем путем ковалентного связывания с органическим гидроксилсодержащим полимером, о тл и ч, а ю шийся тем, что, с целью упрощения пррцесса иммобилизации, расширения области применения иммобилизованной андонуклеазы и увеличения специфичности ендонуклеазы к одному иэ субстратов (PHK или ДНК» в качестве органического гидроксилсодержащего полимера используют аминоетилцеллюлозу, предварительно активированную глутаровым альдегидом, и нроцесс осуществляют в прнсутст» вии соответствующего субстрата.

2. Способ по п.-1, о т л и ч а юшийся тем, что субстрат применяют в количестве 0,2««0,4 вес,%, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. O enn Q.S,, 01 ее D.А., А тГювеп, С-Ь., FvcacOonca5on о1 hn6hoo5es адаi st

ЖорЬм1ососсаМ HvcFeas on Sepho ose

1 т1глмооа сЯ огКеоМ, " Иа1 u e, 225, IP9, 1970.

2. Куриненко 6. М., Калачева И. В., Габдуллина Г, К. Стабилизация нуклеаз ковалентным связыванием с растворимым декстраном. - Бноорганическая химия .

1(4), 483, 1975 (прототип).

Составитель A. Бочаров

Редактор Т, Киселева ТехредЖ.Кастелевич Корректор И. Муска

Заказ 2251/3 Тираж 495 Подписное

UHHHHH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж 35 Раушская наб„д. 4/5

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4