Способ получения иммобилизованной пектиназы

Способ получения иммобилизованной пектиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИ- ЗОВАННОЙ ПЕКТИНАЗЫ путем связывания ее с нерастворимым носителем, содержащим изоцианатные группы, о т л и .чающийся тем, что, с целью упрощения процесса и экономий сырьй/ в качестве носителя используют силохром , обработанный дийзоцианатом адипиновой кислоты,1,6-гексаметилендиамином и повторно - дииэоцнайатом адипиновой кислоты, а связывание фермента с носителем осуществляют в водной среде при 18-20°С и концентрации фермента в исходном растворе 1-3%. (Л с: 00 о:) ел

ИЮ (И) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

gy)) С 12 N 11/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

l г (21) 2606773/23-04 (22) 21.04.78 (46) 23.03.84. Бюл. М 11 (72) З.Я.Муйжниеце, A.Ê.Aðåí, Д.Я.Дайя, В.С.Чудар,,В.Д.Бруматейн, А.Н.Самсонова, И.Н.Богомолова и Н.Ю.Новосельцева (71) Научно-производственное объединение "Биохимреактив" и Всесоюзное научно-проиэводственное объединение консервной промышленности и специалист ной пищевой технологии (53) 577.15.07 .(088.8) (56) 1.Патент Великобритании

М 1259322, кл. С 3 Н, 1972.

2.Патент США Р 3929574, кл. 195-29, 1975 (прототип). (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПЕКТИНАЗЫ путем связывания ее с нерастворимым носителем, содержащим изоцианатные группы, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и экономии сырья, в качестве носителя используют силохром, обработанный днизоцианатом адипиновой кйслоты,1,6-гексаметилендиамином и повторно - дииэоциаиатом адипиновой кислоты, а связывание фермента с носителем осуществляют в водной среде при 18-200С и концентрации фермента в исходном растворе

1-3%.

736592

5i Îí. „5i0-cQ-NH (cH

Изобретение относится к получению иммобилизованных ферментов, s частности пектиназы, которая применяется в различных отраслях пищевой промышленностй и-в научно-исследовательской работе. 5

Иммобилизованные ферментЫ позволяют устранить три важнейшие причины ограниченного применения Ферментов: труднодоступность чистых ферментов, однократное их использование, )p неустойчивость. Иммобилизация, в частности, пектинаэ являетсй важной проблемой, особенно в связи с ее использованием в пищевой промышленности, так как этот фермент в иммо- 15 билиэованной форме обеспечивает мно гократность использования эйзйма, исключает стадию отделения отработав. шего фермента от сока, создает условия для ведения непрерывного процесса, Известно несколько способов получения иммобилизованной пектиназы, однако все они включают трудоемкие этапы синтеза носителей либо основаны на применении высоких температур в процессе получения биокаталиэаторов $1j

Известен способ получения иммобилизованной пектиназы, включающий синтез носителя и связывание с ним фермента в фосфатном буфере, РН 5,0

Фермент используют в виде 10%-ного раствора, реакцию связывания ведут при 4 С t2)

Используемый в способе носитель получают при взаимодействии этиленгликоля с толуилендииэоцианатом при

65 С, причем получаемый носитель обладает активными изоцианатными группами.,: .. .,, . 40

Недостатком этого способа является высокий расход пектинаэы (10%), так как образование системы носительфермент происходит при избытке толу» илендиизоцианата в реакционной смеси, 45 причем одна его часть расходуется йа синтез уретана с актйвными иэоцианатными группами(опреленное количество уретана впоследствии реагирует с ферментом, образуя нужный . 5p продукТ вЂ” препарат реагирует с ферментом, образуя нужный проДукт— препарат иммобилизованной пектиназы), другая реагирует с иэоцианатными гРУппами только что обРазовавшегося уретана, приводя к возникновению уже неактивных в отношении фермента аллофонатнйх групп, а третья, непрореагировашая часть, остается в реакционном растворе. При добавлении фермента к последнему часть знзима, как указано выше, связывается с уретаном и дает пенополиуретановый ферментный препарат, остальная же часть реаги- . рует со свободным толуилендиизоцианатом и при промывке конечного продукта удаляется.

Кроме того, процесс получения комплекса Фермент - носитель сравни« тельно сложныйг работа проводится как при отноСйтельно высоких, так и при нйзких температурах, реакция уре тана с ферментом экэотермична, что требует обеспечения условий,, исклю чающих инактивацию пектинаэы.

Недостатками известного способа являются также относительно небольшая поверхность носителя, так как полиуретановая пена, полученная по описанному способу, обладает макроструктурой, и проведение иммобилизации пектинаэы в среде органических реагентов, отрицательно влияющих на активность ферментов.

Целью изобретения является упрощение процесса, экономия сырья (при обеспечении-высокого выхода активности катализатора).

Цель достигается тем, что в качестве носителя используют силохром, обработанный дииэоцианатом адипиновой кислоты,1,6- гексаметилендиамином и повторно.- диизоцианатом адипиновой кислоты, а связывание фермента с носителем проводят в водной среде при

18-20 С и концентрации фермента в исходном растворе 1-3Ъ.

Согласно изобретению способ получения иммобилиэованной пектиназы состоит в связывании ее с силохромом, обработанным диизоцианатом адипиновой кислоты, 1-6-гексаметилендиами« ном и повторно - диизоцианатом адипи. новой кислоты, причем связывание про водят в водной среде при 18-20 С и о концентрации фермента в исходном растворе 1-3Ъ.

Носитель обладает микроструктурой и вследствие этого значительной поверхностью, что обеспечивает высокую эффективность каталитического действия при наличии связанного фермента.

Эффективность каталитического дейст! вия, как известно, определяется ве-. ,личиной поверхности носителя - чем ! больше эта величина, тем больше на носителе связывается фермента и тем эффективнее действует катализатор.

Обработка силохрома диизоцианатом и 1,6-гексаметилендиамином (последний служит вставкой, обеспечивающей стерически выгодное расположение молекул фермента при связывании) проводится по следующей схеме:

736592

%0-СО-NH-(CH,)<-НСО С г) ь "Н, S и о

1) „,.р,„,),щ.щ „.(,1 щ ФЫ IL

1) %0 C0-NH-(СНД4 ИН" СО ЙН(СН 16 f4H-СО-МЦ-(СН )4-НСО пектина ъа

Ь О СО "Ин (сНД КИ СО ИН снДБ NH сО ИН (сн 4 NcOH N

Gi0-C0- NH-(CHg) 4-КН-СО- КН-(СНД -ЙН-С0-КН-(СНД4- КН-CO- КН- П ек><НА >О

Филиал ППП "Патент", r, Ужгород, ул. Проектная,4

Полученный активированный силохром ие содержит примесей, которые могут влиять на активность препарата или загрязнять впоследствии обрабатываемый бикатализатором сок.

Пример 1. 100 г силохрома

Сх = 1,5 обрабатывают 1,5 ч смесью дииэоцианата адипиновой кислоты и толуола (56 и 159 мл соответственно), затем жидкую фазу отгоняют. Носитель с активированными изоцианатными группами обрабатывают раствором 1,7 г

1,6-гексаметилендиамина в 230 мл 35 дистиллировайной воды в течение 1 ч, затем жидкость отделяют фильтрбванием, носитель сушат до постоянного веса. Далее носитель с активными аминогруппами обрабатывают смесью 40 диизоцианата адипиновой кислоты и толуола (56 и 159 мл соответственно) в течение 5-10 мин, удаляют жидкую фазу отгонкой, а сухой носитель на воронке Бюхнера промывают 400 мл 45 ацетона и сушат до постоянного .веса о при 20 С. К 100 г. сухого активированного силохрома Сх = 1,5 при перемешивании добавляют 350 мл 1Ъ-ного раствора пектиназы в дистиллированной воде, после чего сосуд с реакционной смесью вакуумируют с помощью водоструйного насоса 0,5 ч. Затем суспензию иммобилизованного препарата промывают на воронке Бюхнера

;1,2 л цитратного буфера, рН 4,2,,0,4 л 1 M растовра йаСР и, наконец

0,8 л цитратного буфера, pH 4,2.

Выход биокатализатора 100Ъ (в пересчете на носитель). Активность

0,8 Е/г сухого носителя или 48Ъ от исходной. Выход по белку 22,9Ъ.

ВНИИПИ. Заказ 2363/2

S О-СО-КН-(СНД„-Е-СО-НН-(СН,),- V Н, Связывание фермента на активированной матрице проводится в водной среде при 18-20 С и концентрации энзима в исходном растворе 1-3Ъ по следующей схеме:

Пример 2. Активированный силохром Сх = 1,5 получают так же, как в примере 1.

К 100 r сухого активированного силохрома Сх = 1,5 при перемешивании добавляют 350 мл ЗЪ-ного раствора пектиназы в дистиллированной воде, после чего сосуд с реакционной смесью вакуумируют с помощью водоструйного насоса в течение 30 мин. Далее суспензию иммобилиэованного препарата промывают на воронке Бюхнера 1,2л цитратного буфера, рН 4,2, 0,4 л M раствора МаСР и еще 0,8 л цитратного буфера, рН 4,2.

Выход биокатализатора 100Ъ (в пересчете на носитель). Активность препарата 1,03 E/г сухого носителя.

Пример 3. 100 г силохрома

Сх = 2 активируют аналогично силохрому Сх = 1,5 (примеры 1 и 2).

К 100 г сухого активированного силохрома Сх = 2 при перемешивании добавляют 350 мл ЗЪ-ного раствора ! пектиназы в дистиллированной воде, после чего сосуд с реакционной смесью вакуумируют при помощи водоструйного насоса в течение 30 мин. Суспензию иммобилизованного фермента промывают на воронке Бюхнера 1,2 цитратного буфера, рН 42, 0,4 л 1 M раствора КаСР и, наконец, еще 0,8 л цитратного буфера, рН 4,2.

Выход биокатализатора 100 Ъ (в пересчете на носитель). Активность препарата 1,09 E/ã сухого носителя.

Тираж 52 2 Подписное