Способ очистки гепарина
Иллюстрации
Реферат
Союз Советскнх
Соцнапнстнческнх
Респубпнк (1 7.3686О
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (6i ) Дополнительный к патенту (22) Заявлено04.03,76 (21) 2457090/28-13 (53) М. Кл. (2З) Приоритет - (З2) 05,03,76
А 61 К 35/42
5 01 К 33/16
Государственннй коми тет
СССР
llo делам изобретений и открытий (33) Швеция (3() 76030402
Опубликовано 2505.80. Бюллетень ¹ 19„ (Щ УДК615.45:
: 615. 361: 36 (088. 8) Дата опубликования описания 2605,80
Иностранцы
Ларс-Олов Андерссон и Эрик Ингве Холмер (Швеция), (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма 1АБ КАБИтi (Швеция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ГЕПАРИНА
Изобретение относится к химикофармацевтической проьыиленности, а именно к очистке гепарина.
Известен способ очистки гепарина путем осаждения комплекса гепарин» белок „Чоляной кислотой, протеоли-. тического разрушения белка, многократного переосаждения целевого продукта и пропускания через ионообменные смолы. Активность гепарина
100 ед/мг, Белью изобретения является повышение активности целевсго продукта, Это достигается тем, что гепарин растворяют в. буферном растворе с
: рН от 5 до 9,5, адсорбируют на гель сефарозы, коньюгированный с анти,тромбином или с интер-d.-трилсином и элюируют буфером. Пример 1, Очистка гепарина на связанном с матрицей гепарине.
Гелевый адсорбент прйготавливают следующим образом, 3 г ВгСет растворяют в 30 мл дис,тиллированной воды. 50 мл осажден ной агарозы добавляют к раствору
В СИ. Смесь при перемешивании охлаждают в водяной бане. При добавле нии 4М NaOH поднимают рН до 11,2 и выдерживают постоянным в течение
10 мин. Затем гель промывают холодной дистиллированной водой и
0,2 М йаНСО3.
200 мг антитромбина, очищенного по Миллеру-Андурссону и растворенного s 50 мл 0,2 М NaHCO>, при рН 9;0 .добавляют в гель. Гель-протеиновую суспенэию осторожно перемешивают йри комнатной температуре в «течение ночи и затем осторожно промывают с буфером при высокой концентрации ионов при попеременно высоких и низ ких значениях рН.
Гелевый адсорбент, содержащий связанный с матрицей антитромбин, помещают в колонку и уравновешивают с 0,05 М. триса, 0,15 М NaCO, рН буфера 7,4, 300 мг гепарина/индивидуальная активность 130 ед/мг) растворяют в 20 мл 0,05 М триса, 0,15 М NaC(рН буфера 7,4 и прокачивают через колонку. После этого гель промывают буфером, а адсорбированный гепарин затем десорбируют
0 05 М триса, 1,0 М НаСс, рН буфера
7,4. Из элюированного гепарина удаляют соль путем фильтрации геля в дистиллированной воде в колонке, заполненной сефадексом g- 25, после @ чего гепарин высушивают выморажива4
3 -, . . . ° " 736860
Формула изобретения
Составитель С. Малютина
Техред И.Асталош Корректор М. Коста
Редактор A. Бер
Заказ 2456/49 . Тираж 673 Подписное
БНИИПИ Государственного комитета СССР по долам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5
Филиал ППП Патент, r. ужгород, ул, Проектная, 4 наем. Изучение распределения моле- . кулярных весов показывает, что он имеет значительно более ограниченное распределение молекулярного ве са, по сравнению с первоначальным гепарином, Пример 2. Антитромбиновую матрицу готовят по способу, указанному в примере 1.
Очистка гепарина: 500 мг гепарина/активность 130 ед/Mx ) растворяют в 300 мп 0,05 М триса, 0,15 М йаС(, рН буфера 7,4. 300 мл осажденного связанного с матрицей антитромбина уравиивают в буфере И высушивают отсасыванием. Адсорбент добавляют в раствор гепарина, который затем перемешивают при комнатной температуре в течение однож часа, Гель высу-шивают отсасыванием на стеклянном фильтре и промывают 10 > 200 мл
0,05 М триса, 0,15 М НаЯ, рН буфера 7,4. Адсорбированный гепарин затем десорбируют иэ геля путем применения 3 + 200 мп 0,05 М триса, 1,0 М NaCf рН буфера 7,4. Элюированный геларин концентрируют высушивают вымораживанием,., Оставшуюся соль удаляют фильтрацией геля на
Сефадекс 6-25 в дистиллированной воде и затем гепарин высушивают вымораживанием. Активность очищенного гепарина 250 ед/мг.
II р и м е р 3. Очистка гепарина на гелевом адсорбенте, содержащем связанный с матрицей ингибитор интер-a(-трипсин, Приготовление гепевого адсорбента,.
В ходе очистки фактора коагуляции (х(В - фактор) получают интер-oL-трипсин ингибитор протеин-связывающего гепарнна. Его мол. в. 150000, 250 мг этого протеина растворяют в
200 мп 0,2 М йаНСО, рН буфера 9,0 и затем добавляют к 50 мл осажденной сефароэы R4B, активированной с
BEACH аналогично примеру 1.
Гель-протеиновую суспенэию осторожно перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Затем гель проьывают так же, как в примере 1, Очис ка гепарина.
Гелевый адсорбент, содержащий связанный с матрицей протеин, помещают в колонку, 300 мг гепаринарастворяют в 20 мп 0,05 М триса, 15 0 15 М NaCC, рН буфера 7,4 и прокачивают через колонку.
Гель промывают буфером и адсорбированный гепарин затем десорбируют
0,.05 М триса, 1,00 М ЙаСЕ, рН буфе
20 ра 7,4. Соль удаляют иэ гепарина путем фильтрации геля на Сефадекс
G-25 в дистиллированной воде и затем гель высушивают вымораживанием. Активность очищенного гепарина
25 230 ед/мг.
Предлагаеьий способ позволяет повысить активность целевого продукта, Способ очистки гепарина путем адсорбции, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, гепарин растворяют в буферном растворе с рН от 5 до 9,5, адсорбируют на гель сефароэы, конъюгированный с антитромбиком или с интер-(-трипсином и элюируют буфером.