Способ получения антибиотика

Способ получения антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С-А Н H E

ИЗОБРЕТЕНИЯ

4-е©з Саеетеинх

С @н@лиетиивеиих реенублии

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлене16,0475 (21) 2124245/13 (23) Приоритет - (32) 17 0 4 74 (3! ) Р 461635 (33) Craw

С 12 D 9/00

Государственный комитет

СССР оо делам изобретений н открытий

Опубликовано 250580. Бюллетень JA

Дата опубликования описания 26,05,80 (53) УДЯ 615. 779, .9 (088. 8) Иностранцы; (72) Авторы Давид Гленн Мартин и Ладислав Джеймэ Ханка изобретения (США) Иностранная фирма ТЭ Апджон Компани (COIA) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к области медицины, в частности к производст. ву антибиотиков.

Способ получения антибиотика

U --43 795, в патентной и специальной литературе не описан.

Предложен способ получения нового антибиотика U-43,795, общей формулы Н с-он 10

4 Ф сн сн сс

Ь «нн заключающийся в том, что культуРу

Streptoegces sviceus йрQz5439 выращивают в водной питательной среде,со- 15 держащей источники углерода, азота или белковый материал с последующим выделением целевого продукта известными приемами.

К углеродным источникам относятся глюкоза, коричневый сахар, сахароза, глицерин, крахмал, кукурузный крахмал,лактоэа,декстрин,меласса;к источникам азота - жидкость после замочки кукурузы,дрожжи,автолизован" ные пивоваренные дрожжи с твердыми веществами молока, соевая, хлопковая и кукурузная мука, твердые вещества молока, продукт переваривания казвина поджелудочной железой, барда, животные пептонные жидкости мясные и костяные отбросы. Преимущественно применяют сочетания этих углеродных и азотных источников..

Для инокуляции применяют вегета тивную форму микроорганизма, а не его споры.

Вегетативный прививочный материал получают путем инокуляции почвенной . культуры Shr. otivaceus NRR15439 в пи" тательном бульоне и пересева на скощенную среду. Молодой прививочный вегетативный материал в асептических условиях переносят в ферментер.

Процесс ферментации проводят при

20-32 С, РН среды 5,5-7,0, оптимальное образование антибиотика наблюдается в течение 2-10 дней.

Для выделения и очистки 0 -43,795 может быть прйменен ряд различных методов, например абсорбция с последующим злюированием растворителем, хроматография на колонке, час" тичная хроматография кристаллиэация с выделением из растворителя, Антибиотик U-43,795 выделяют из культуральной среды фильтрацией через диатомит (fW 40).

Прозрачную питательную среду фильтруют через хроматографическую

736875

tO

РФ

Зоны .нет

То же

Сильная

29, Ц вЂ” 43,795 колонку, наполненную смолой сульфокислоты стиролового типа, Колонку . промывают, антибиотик элюируют основанием. Элюаты антибиотического действия смешивают и концентрируют.

Полученный водный концентрат фильтруют при нейтральном рН через, колонку содержащую слабо основную Попиавасновую смолу стиролового типа

Колонку промывают деиониэированной водой, 50%-ным водным метанолом, эа. тем элюируют уксусной кислотой в

9%-ном метаноле.. Активные фракции элюата смешивают, затем упаривают досуха под пониженным давлением.

Полученный остаток хроматографируют на силикагеле 60 в системе метилэтилкетон-ацетон-вода (65:20:15) ° Получают относительно чистый препарат антибиотика 0-43,795.

В процессе выделения антибиотика проводят биоанализы с использованием

AacitFus эоЬОбз (1! .

Пример. Ферментация.

Почвенный штамм бактерий etrepto ceS

svieeus 98RRR5439 инокулируют в колбах Эрленмейера (емкостью 500 мп) со 100 мп.стерильной среды содержащей 25 г/л декстроэы, 25 г/л

РЬагппвчед ь и до 1 л водопроводной воды, рН среды до стерилизации 7,2. прививочный материал выращивают на протяжении 2 дней при 28 С на вращающейся виброустановке при 250 об/мин.

Полученным прививочным материалом инокулнруют в колбах Эрленмейера емкостью 500 мп 100 мл стерильной ферментационной среды следующего состава, г/л:

МН,„СЕ 5 углерод 2 Крахмал кукуруз ный 10. . Промытые дрожжи 2,5

Кау 5 оу . 20

-Ферментационная среда также содержит 1 мп олеомаргарина из свинного сала и до 1 л водопроводной воды; рН среды. перед стерилизацией доводят до 7 2 4Н гидроокисью натрия.

Ферментационные колбы инокулируют в соотношении 5 кп прививочного материала на 100 мл ферментационной среды. Затем выращивают 2-3 дня при 32ОC на вращающейся виброустановке при 250 об/мин.

Выделение. 250 л ферментационной среды фильтруют через диатомит средней пористости. Полученную прозрачную питательную среду пропускают через хроматографическую колонку, содержащую 25 л свежерегенерированного 0омех50 х 16 (Н+), при рН 7-8.

Колонку промывают 50 л деиониэированной воды, элюируют 120 л 1Н

ИН4ОН, собирают 6 л фракционного материала. Активные фракции смешивают н концентрируют под пониженным давлением для удаления избытки

Н Н4ОН.

Очистка. Колонка со слабо основной полиаминовой смолой стиролового а типа, 2О Активный водный концентрированный элюат Dowel 50, полученный опи-санным способом, рН 7-7,5 пропускают через колонку, содержащую 4 л

Amber(.И 45 (ОН ) . Затем колонку промывают 8 л деиониэированной во. ды, 4 л 50%-ного водного метанола и 8 л 90%-ного водного метанола.

Собирают 2 л фракционного продукта.

Наиболее активные фракции, определенные тестом BcsciBus subtitis, смешивают и упаривают досуха под пониженным давлением.

Хроматографи я, При проведении этого процесса применяют силикагель

60, Реакцию осуществляют на остатках 3R 54(ОН ), полученных описанным спосббом. Активные фракции, полученные иэ колонки Ж 45 упаривают досуха; уксусную кислоту вымывают водой.

Полученный остаток суспендируют в

4() 328 мл воды и упаривают до 33 r силикагеля. Колбу затем промывают

5 г свежего силикагеля. Гомогенный порошок хроматографируют на колонне с силикагелем, полученным суспендированием 600 г,силикагеля в системе метилатилкетон-ацетон и вода (65:20:15). Элюируют этой же смесью (7200 мл) собирая вначале

1200 мп и затем фракции 1-12 по

500 мп.

Результаты приведены в таблице.

736875

Продолжение таблицы.О -43,795

То же

Средняя

То же

О -43, 795+AT - 125

AT 125

AT-125

AT-125

Средняя/слабая

Слабая

60

То же

1 °

47

° !

12

Наносят в виде капель разбавленные фракции 1-10

34 В виде капель на пластину с силикагелем. В системе метилзтилкетон-ацетон-вода (65:20: 15) на силикагельной пластине; Обнаружение нингидрином.

Фракции 3 и 4 смешивают и упари- ° При ТСХ U -43,795 получают вают.под пониженным давлением при зону после опрыскивания пласти

40вС, остаток растирают с метано- раствором нингидрина.Пластины лом. Получают 1,.37 .r чистого являют в системе тетрагидрофур

U-43,795, Перекристаллизацией иэ -ацетон-вода (50:30:20), R<=0» водного метанола получают"аналити- Химическая структура U -43, чески чистый U --43,795 в виде его в кристаллической форме устано кристаллического гидрата. Воду мож- днфракцией рентгеновскими луча но удалить сушкой. o($, 4S, 5R А-амино-3-хлор-4ИК-спектр ньюелевой растирки частичного гидрата 0 -43,795 определяют спектрофотометром Pevkin Either

421,. Пики найдены при 3620, 3140, 2710, 2620,. 1660, 1640,. 1610,. 1585

1525 1385, 1325, 1310, 1270, 1255ig

1180, 1135, 1110, 1075, 980 915

800, 865, 805 н 705 см (5h -плечо) .

Формула изобретения

Кольцевой дихроизм 0 -43„795 показывает в. воде /О/grgg + 60,000 и

/О/Д02 - 47,000, Полученный антибиотик U -43,795 характеризуется следующими свойствами:

ЯИР-спектр насыщенного раствора U-43,795 в О, О определяют спектрометром Vor ianX 7 -100-15. Спектр

100 мГц ясно показывает наличие трех незаменяемых протонов. Метиновый протон у С-4 виден в. качестве кажущегося дублета при 5,34 с линейным разделением 8,2 Гц. Соседний протон у С-5 виден в качестве кажущегося дублета дублетов, центрированных при 5,19 с линейным разделением 3,4 Гц и 8,2 Гц. Сигнал метина аминокислоты представляет собой кажущийся дублет при 4,43 с линейным разделением 3,4 Гц. одну ны проан55.

795 нлена чи окси -2-йзоксаэолин-5-уксусная кислота, Мол. в, 212,59. Растворяется в воде и незначительно в метаноле, относи,тельно нерастворим в этилацетате, простом эфире, бенэоле и хлороформе.

Антибиотик U -43,795, являясь

40 амфотерным соедниением, образует соли с кислотами, щелочнымн металлами (включая аммиак), щелочноэемель" ными металлами (включая магний и алюминий) и аминами.

Q --43,795 поддается ациллированию с помощью соответствующего галлогенангидрида кислоты или ангидрида кислоты или сульфенилгалогенида, образуя соответствующее бис-ацильное производное, где 4-гидрокислый и

4,-амино-водород ациллированы.

Антибиотик 0. -43,795 активен против Вас. эс4Щ и 5с гс пи Меси, мышиной лейкемии типа 1210, Способ получения антибиотика общей формулы н е-он

oL . сн-сн -со

О ++)H3 отличающийся тем, что, культуру Sfrepforrigces svicqus NRR2, 45 5439 выращивают на среде, содержа736 875

Составитель Р. Смирнова

Редактор А. Бер Техред М.Кузьма Корректор Г. Решет ни к

Заказ 2465/50 Типам 522 Подписное

ПНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открьпий .

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Уигород, ул, Проектная, 4 щей источники углерода, азота, мине ральные соли, с последующим выделением целевого продукта известными приемаэв.

Источники информации принятые во внимание при экспертизе

1.Aufiwicreblaf А ен1з о 4 еЬевзй егар9

03 ° 1973, vs 3, р. 425-431.