Способ определения активности протеаз серина

Способ определения активности протеаз серина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ри736889Сеюз Советскими

Соцреалистических республик

К ПАТЕНТУ (6() Дополнительный к патенту (22) ЗаЯвлеио30.1177 (21) 2548501/28-13 (51) М. Кл. (23) ПРиоРитет - (32) 01.12 ° 76

@01 Н 33/16

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (3 I ) 76 1346 3-4 (ЗЗ) Швеция

Опубликоваио250580 Бюллетень N 19, (53) УЙЙ616-078 (088.8) Дата опубликования описаиия 260580

Иностранцы

Карл Геран Клаесон, Лейф Эрик Аурелл и Лейф Роджер Симонссон (Швеция) (72) Автори изобретения

Иностранная Фирма Актиеболагет Каби (Швеция) (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ СЕРИНА

Изобретение относится к биохимии

Известен способ определения активности протеаз серина путем воздействия ферментосодержашего материала на энзимный субстрат (1).

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности определе ния активности протеаэ серина, Пелью изобретения является повы-, шение точности способа

Это достигается тем, что в качестве субстрата используют вещество общей формулы

g,- идв-А-гли-арг-ки-g,, где В,(- ацил, преимущественно ацетил или бензоил; иле - изолейцин;

A - -аспарагиновая или глютаминовая кислота, замешенная в карбоксильной группе образованием сложного эфира с коротким алкилом, оксиалкилом, замешенным аминоалкилом или циклоалкилом, или амидированием моно- илн диэамещениым ,коротким алкилом, оксиалкилом, замешенным аминоалкилом или гетероцикли2 ческой группой,у KoTopoN азот амидной группы обра эует участок пиперидинового морфолинового или

6 пипераэинового кольца; гли - глицин; арг - аргинин;

В -и - нитрофенил.

Субстраты: получают Hs хромоген1® ных или флюорогенных субстратов содержащих аминокислоты в последовательности соответственно ил-глю-гли-арг-и-ил-асп"гли-арг посредством образования сложно® фирной группы или амидирова1. я свободной )Гили р -карбоксильной группы известным способом.

При тонкоспойном хроматографическом анализе экстракта из адсорбента и продуктов в качестве абсорбционной среды берут стеклянйые пластинки с силикагелем F -254. Йспользуют систему растворителей: хлороформ - * метанол-уксусная кислота - вода в соотиааеиии 34:4:9:2. После тонкослойиой хроматографии пластинки исследуют сначала в ультрафиолетовых лучах (254 нм), а затем с помощью хлортолуидиновой реакции, Все использованные аминокислоты при.отсутствии

7 36 8 89 других указаний имеют Ь -конфигура" цию, Приняты следующие сокращения:

Apz - аргинин,aczz - аспарагиновая .кислота, .глю - глютаминовая кислота, гли — глицин, иле -.иэолейцин, лей лейцин; Ас - ацетил, AcOH - уксусная кислота, В - бензоил, RECCE дициклогексилкарбодиимид, ЬМФ - диметилформамид, Е1 н - триэтиламин, НОВТ - оксибензотриаэол, НО5о

N-оксиимид янтарной кислоты, МеОН метанол, OEt — этилокси, ОМе, -метилокси, Op Np -. п-нитрофенокси, Oi$оР) изопропилокси, pNA - п-нитроанилид, GAE - четвертичная аминоэтилсефароэа, SOCKS - хлористый тионил.

Пример 1 . Субстрат Бензоил-ил-глю-арг-и-нитроанилид (S-2222)

Bz-ил-глю-(OMe) -гли-арг-pNA НСГ (мол.в. 748,2).

В беэнодных условиях при 0 C

30 мл .дистиллированного SOC qZZo,бавляют к 0,5 мл абсолютного метанола, После первоначальной реакции раствор оставляют стоять примерно на 15 мин при комнатной температуре, затем добавляют 75 мг В - -ил-глю-гли-арг-pN A .НСС (S- .222) Раствор перемешивают н течение 5 ч, затем упаривают. Полученный маслообразный продукт растворяют в небольшом ко= личестне метанола и очищают по способу храматографиронания на геле на колонке, содержащей Сефадекс ZH20 в среде метанола, Для отмынки с адсорбента также применяют мета-. нол. Чистый сложный метиловый эфир, полученный после выпаривания метанола, растворяют н воде и нысушивают в замороженном состоянии. Выход

30 мг (40%). Продукт однороден по. данным тонкослойной хроматографии, Ry = 0,33/A/р минус 40,3 (с

О, 5, 50% НАОс /H ZO), Пример 2. Bz-ил-глю(Оtt)—

-гли-арг- )(А НС8 (мол,в. = 762,2) .

В безводных условиях при температуре минус 10 С 60 мл дистиллированного БО. СС,, добавляют к 1,0 мл абсолютного этанола. Через 30 мин при комнатной температуре добавляют

150 мг субстрата 5-2222. Примерно через 15 ч по окончании реакции (по данным тонкослойной хроматографии) раствор выпаривают, Полученное масло растворяют в небольшом количестве 30%-ной НОАС в воде и очищают посредством хроматографирования на колонке, содержащей Сефадекс

-С 15 в среде 10%-ноГо водного раствора. НОАС. Чистый сложный этило.вый эфир, извлеченный из адсорбента, высушивают в замороженном состоянии. Выход 70 мг (46%), Продукт однороден по.данным тонкослойной хроматографии, R = 0,40 /d(> минус

37,7о (с = 0,5,50% НОАС/Н О) °

Пример 3. Bz-ил-глю(0 $ОР )-гли-арг-р GAIA НСГ (мол,в, 776,3), g

Осуществляют синтез по примеру

2, однако вместо эталона берут абсолютный изопропанол. Реакция заканчивается через 16 ч. Хроматографиди ке получают хлори сто водородную соль сложнОго диметиламиноэтилона го эфира, свободную от примеси других пептидов, однако продукт содержит незначительное количество некоторых загрязняющих примесей, например хлористоводородной соли диметил50 аминоэт анола, Фракцию, содержащую,сложный диметиламиноэтиловый эфир, упаривают и очищают хроматографированием на колонке, содержащей, Сефадекс 15 в 10% HOAc/Н О, Раствор чистого сложного эфира высушивают

B замороженном виде. Выход 60 мг (58%) . Продукт однороден по данным тонкослойной хроматографии, Rg =— 0.50 ((. I g ìèíóñ 35,0 (с =- 0,5, 50% НОАС/Н О) .

СОИ -СН(СН )

П р и и е р б. В -ил-r 1þ-гли-арг-рНА (мол.в. 775, 3) °

65 ронание и высушинание н замороженном состоянии .проводят по методике, приведенной н примере 2. Выход

90 (58%). Продукт однороден по. данным тонкослойной хроматографии, R =0,44 /с .!н минус 36,4 (с

0,5, 50% НОАС/Н О), Пример 4. Bz -ил-глю-(О-циклогексил) -гли-арг-р и А НСЕ

1 (мол, н. 833, 3) .

60 мл SO

200. мг S 2222, По окончании реакции, примерно через 12 ч, раствор

20 упаринают и хроматографируют как указано в примерах 2 и 3 ° Затем продукт высушивают в замороженном состоянии. Выход 170 мг (75%), Продукт бднороден по данным тонкослойной

25 хроматограФии, 7.< = 0,50 /c< / "минус

38,6 (с = 0,5, 50% НОАС/Н, О) .

Пример 5. Bz-ил-глю-(О-CH>CHz N(CH> ) <-гли-арг-р N А НСГ (мол.в. 859,8) .

75 г (О, 10 ммоля) субстрата

$-2222 и 100 мг диметил-аминоэтанола-гидрохлорида растворяют в 1, О мл сухого дистиллированного ДМФ, затем добавляют 10 мл лириднна, 10 мг

НОВТ и в заключение добавляют 25 мг

DCCC. Образовавшийся дициклогексилкарбамид отфильтронываюг примерно через 24 ч и диметилформамидный раствор упаривают при пониженном давлении. Оставшееся масло растворяют в небольшом количестве 35% МеОН5% H О и очищают на колонке, содержащей ионообменник OAE — 25 в его хлоридной форме, Ту же самую смесь растворителей используют для отмыв45 ки с адсорбента. Согласно этой мето736889

740 мг субстрата S-22 2 НОВи растворяют в 1 мл сухого дистиллиро. ванного МФ, Раствор охлаждают до минус 5 "С и добавляют 120, мг 1)CCE °

Температуре дают подняться до комнатной и спустя 4 ч раствор ннов о охлаждают до О С, выделившийся в ниде осадка дициклогексилкарбамид отфильтровывают и промынают, DMC-ðàñòвор (около 2 мл) охлаждают до О С и добавляют 0,1 мл чистого изопропиламина. Через 70 ч ныдерживания при, комнатной температуре раствор выпаривают при пониженном давлении, смешивают с 5 мл воды и вновь выпаривают. Продукт растворяют примерно н

4 мл 50% НОАС/Н О и очищают хроматографированием на колонке, содержащей Сефадекс С-15 в среде 33%

НОАС/Н О. Эту же смесь растворителей используют для отмывки с адсорбента. Фракцию, содержащую чистый 20 изопропиламид, упаринают и подвергают ионному обмену в колонке, содержащей четвертичную аминоэтилсефаро 3у АЕ 25 н ее хлоридной форме, растворенной в 95% МеОН-5% НО.

Экстракт из адсорбента выпаривают, растворяют H ноде и высушивают н замороженном состоянии ° Выход 120 мг (47%) . Продукт однороден по данным тонкослойной хроматографии, Р 30,39

/с(/ Я минус 30,6 (с = 0,5, NeOH).

П. р и м е р 7. В -ил-глю-гли-.

СОН Н )

-арг-рНА (мол. в. 802, 3)

Синтез осуществляют по примеру 35 б, однако используют пиперидин взамен изопропиламина, Выход 105 мг (40%) . Продукт однороден по данным тонкослойной хроматографии, R.y =0,50 /cC / -" минус 34 (с = 0,5, 4р

МеОН) .

Пример 8. BZ-èë-глю гли-; . C O N (C H gCl4z Ott)

-apr-рИА (мол. н. 822, 3)

Синтез проводят по примеру б, но применяют диэтаноламин вместо изопропиламина. Выход 120 (45%), Продукт однороден по данным тонкослойной хроматографии, Ay=0,25 /(,/ минус 31 (с = 0,5 МеОН), Пример 9.Bz-ил-асп- 50 (oi 5оРт. ) -гли-арг-р Н А HCf. /мол. ь.

762,3), 30 мл дистиллированного SOCP<добавляют к 0,5 мл сухого изопропанола и после 30 мин стояния при ком- 55 натной температуре добавляют 73 мг (О, 10 ммоля) В -ил-асп-гли-apr-pN А.HCC (мол.в. 720,2) . По окон-. чании реакции, примерно через 18 ч,, раствор упаривают, хроматографируют gp и высуши вают в з амороженном состоянии, как указано н примерах 2,3 и 4, Выход 32 мг (42%) . Продукт однороден по.данным. тонкоутойной хроматографии R у =0,46 /с(/ 1ъ минус 22,7 (c - О, 5, 0% HOAc/H 0) °

Пример 10, В -ил-асп(ОЕ1) -гли-арг-р И А-HCP. (мол,в.748,2), ;Синтез проводят по примеру 9, но вместо изопропанола применяют эталон . Выход 2 8 мг (37% ) . Продукт однороден по данным тонкослойной хроматографии R =0, 40 ld./ ìèíóñ

23,5 (с = 0,5, 50% НОАС/Н О) .

Пример 11. Bz.— èë-асп-глиI

- СОНИ-СИ(СИ 1

-apr-р NA HCC (мол,в. 761,3).

Синтез проводят по примеру 6 но применяют Bz-ил асп-гли-арг-р NA HCE в качестве исходного материала вместо 5-2?22, Выход 100 мг (40%).

Продукт однороден по данным тонкослой ной хроматографии, Rg = О, 40 /с(! > минус 20,1 (с = 0,5, МеОН) .

Пример 12. Bz-ил-асп-глиCON

-арг-р НА (мол-. в. 818, 3) .

Синтез проводят по примеру 11, . но применяют морфолин взамен иэопро-, пиламина. Выход 95 мг (35%). Продукт однороден по, данным тонкослой ной хроматографии, R g = 0,46(сС/ минус 24,20 (с = 0,5 MeOH) .

Определения К,„и / с (К1 — константа Михаэлиса Ч„„с„ с — максималь-, ная скорость), получают, применяя уравнение Лайнвевера-Бурка:

1 К„н 1

"g 6 кщсэо мсек.

Затем смешивают с субстратом в буферном растворе и определяют спектрофотометрически скорость гидролиэа.

Концентрацию субстрата ()О) измеряют, а концентрацию энэима сохраняют постоянной. Затем значения величинн, о брат ныХ скорости — „, от кл адывают на графике относительно значений обратной концентрации ф . По полученному графику Лайнвевера—

Бурка определяют) „,чЧ„„ (см. таблицу), Субстракт растворяют в воде до

2 ммолей/л, буфер, энзим и субстрат, Смешивают и отсчитйвают изменение абсорбируемости (а О Ц/мин) при

405 нм при 370 С.

Предлагаемяй способ с помощью хромогенных субстратов обеспечивает высокую чувствительность и точность определения в течение короткого времени, что позволяет проводить анализ большого количества образцов.. 736889

KI11- 10

4 моль/л

Субстрат

Чм1экС 10 в моль/мин Ч. Относительная активность

8,6

100

8с3

2,6

230

8., 1

2 у 9

200

7,5

220

7,1

340

5,6 20,0

8,6

300

lg7

Формула йзобретения

Я -им,-A-rw-cspr-Èè-R я, 1 я„= адил, йреимущественно ацетил или бензоил1 иле - иэолейцин;

А - аспарагиновая и. глютаминовая-кислота, замещенная в карбоксильной групПе, образованием сложного эфира с коротким алгде

СоСтавитель С. Малютина

Редактор T. Смирнова Техред И.Асталош, рр

Ко ектор Г. Решетник Заказ 2474/50 Тирах 1019 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий .

113035, Москва, Ж»35, Раушская .наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул, Проектная, 4

S2222

Пример 1

Пример 2

Пример 3

Пример 6

Пример 7

Способ определения активности протеаз серина путем воздействия ферментосодериащего материала на энзимный субстрат, отличающийся тем, что, с. целью повышения точности способа, в качестве субстрата используют вещество общей формулы килом, оксиалкилом, э амещенным аминоалкилом или циклоалкилом, или амидированием моно- или диэа

20 мещенным коротким алкилом, оксиалкилом, эамещенным аминоалкилом или гетероциклической группой, I у которой азот амидной группы образует участок пиперидинового морфолинового или пиперазннового кольца; гли - глицин; арг - аргинин;

В - ъ — нитрофенил

Источники информации, .принятые во внимание при экспертизе

l. Тейеи A.II., Лни M., Абильдгаард У.. Исследования в области

З5 .тромбоза. 1976, 8, 413.