Способ получения фермента днк-цитозин-метилазы 1 из клеток

Способ получения фермента днк-цитозин-метилазы 1 из клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

< 737443 г (51)M. Кл.

С 1 2 DI3/10

/ (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 27. 10,77 (21) 2537615/28-13 с присоединением заявки .% (23) Приоритет

Опубликовано 30.05.80 Бюллетень № 20

Дата опубликования описания 30 05 80

Гасударственный комитет

СССР (53).УДК 577. .15,08 (088.8) но делам изобретений

- н открытий (72) Авторы изобретения

В. ф. Нестеренко, Я. И. Бурьянов и А, А. Баев

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

АН СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДНК-БИТОЗИНМЕТИЛАЗ61 1 ИЗ КЛЕТОК ESGHERXCHTA С,ОЫ

МЮ QOO

Изобретение относится к способам— получения ферментов из микроорганизмов, а именно к способам получения гомогенных ДНК-метилаз, Наиболее близким по технической сущности к заявленному является способ получения фермента ДНК-цитозин-метнлазы

1 из клеток Ебсттегтс1тта CoU tARE6QO предусматривающий дезинтеграцию биомассы, центрифугирование при 165000ф, 10 осаждение из полученного бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот, фракционирование белкового раствора сульфатом аммония, обессоливание фракций, содержащих фермент, для чего их собирают

15 центрифугированием, растворяют в минимальном объеме буфера, диализуют и хроматографируют íà колонках с ДЕАЕ-сефадексом А -50 и фосфоцеллюлозой (11.

К полученному раствору добавляют равныйобъем глицерина и хранят при темо пературе — 20 С.

Описанный метод не позволяет получить ферментный препарат ДНК-метила2 зы с достаточной степенью чистоты; конечный продукт содержит 85% примесей, Кроме того, при очистке в Ig0 раз выход не более 8% (от обшей активности), Белью изобретения является получение гомогенного препарата и увеличения выхода фермента, Бель достигается тем, что перед стабилизацией белковый раствор хроматографируют и рехроматографнруют íà ДНК-агарозе, затем хроматографнруют на КМ-целлюлозе и полученный раствор пропускают через последовательно соединенные колонки с ДЕАЕцеллюлозой и фосфоцеллюлозой рП, при этом центрифугирование гомогената, осуществляют при 10000-3000, осаждение нуклеиновых кислот проводят протаминсульфатом, обессоливание фракций ведут гельфильтрацией на сефадексе G-25, а стабилизацию ферментного препарата осуществляют диализом против раствора глицерина, Осаждение нуклеиновых кислот осу7443

10

15 0

3 73 ществпяют 0,5-0,6%-ным раствором npo--

T& м инсул ьфята.

X рома тографию на Д НК-агар озе ве ду т в линейном градиенте хлористого натрия от 0,1 до 0,6 М.

Рехроматографию на ДНК-агарозе веачт в линейном градиенте хлористого нат» рия от 0,1 до 0,3 N.

Хроматографию на КМ вЂ” целлюлозе ведут в линейном градиенте хлористого натрия от О до 0,1 М.

Диализ ведут в течение суток против

2-х кратного объема 60% раствора глицерина в ФЕМ-буфере.

Сущность сйособа состоит в том, что

«летки E. СО11МКЕ 600, выращенные до конца логарифмической стадии роста пезинтегрируют в буфере. Полученный гомогенат центрифугируют при 1000030000у После центрифугирования вбесклеточный экстракт добавляют протаминсульфат для осаждения нуклеиновых кислот и сопутствующих метилаз. Полученный супернатант фракционируют сульфатом аммония, Осадок, растворенный в буфере, обессоливают на колонках с сефадексом С-25. В обессоленный раствор добавляют хлористый натрий и фпакционируют на колонке с QEAE-сефадексом

Фракцию с ДНК- метилазной активностью концентрируют высаливанием сульфатом аммония. Осадок растворяют в буфере и помещают на колонку с QHK — агарозой. Фракции с ДНК вЂ” цитозин - метилазой 1 объединяют, концентрируют ультрафильтрацией, разводят буфером, рехроматографируют на ДНК вЂ” агарозе.

В отличие от"ЖЪа гпсщ Р -Il фос фоцеллюлозы, которая применялась ранее на этом этапе, ДНК-агароза является более мягким ионообменником и обладает высокой удельной емкостью с повышенным сродством к ферменту. Процесс приготовления J1HK-агарозы нетрупоемкий, При хроматографии фермента на ДНК-агарозе результаты хорошо воспроизводимы, фермент меньше инактнвируется. Таким образом, применение IlHK-агарозы на этом этапе позволяет получить фермент с высокой степенью очистки н большим выходом, Выход фермента на этой стадии составляет 57%..

Собранную активную фракцию далее крнцентрируют на" %% а1,man" P-ll фосфоцеллюлозе, хроматографируют на КМцеллюлозе. Фракции, обладающие активностью, объединяют и наносят на последовательно соединенные колонки с ДЕАЕцеллюлозой и фосфоцелпюлозой. ДНК-цитозин-метипазу 1 элюируют в фосфоцеплюпозной колонке с буфером. Затем раст.вор пиалнзуют против глицерина.

Пример. 5 кг биомассы ЕэсЬ г ck a СоЕ, МКЕ 600 разрушают при температуре +4 С на прессе Мс п оп QouEin%as. о

Разрушенные клетки суспендируют в 15 и

0,02 М трис-НС 6 буфера рН 7,4, сопержащего 5%-ныйглицерини 7 мм меркаптоэтанол (ТМ-буфер) . Все последующие стадии проводят при температуре 0-4 С, Неразрушенные клетки и дебрис удаляют центрифугированием при 10000< в течение 30 мин. Надосадочную жидкость используют для выделения фермента.

К 16 литрам бесклеточного экстракта в течение полутора часов при перемешивании добавляют порциями 5 литров

2,09о протаминсульфата, Осадок удаляют центрифугированием при Ippppy в течение 30 мин

К 19 лн рам надосадочной жидкости добавляют сукой (йН4) «;О, по 40% îi

25 полного насыщения. Осадок удаляют цент рифугированием, К полученному супернатанту добавляют сухой (Н )Я04до 609o от полного насыщения. Осадок собирают центрифугированием и растворяют в

1000 мл ТМ буфера. Раствор .делят на две разных части и наносят на колонки (5х70 см) с сефапексом Q-25, уравновешенном ТМ буфером, Объем обессоленного раствора доводят до 4 л и добавляют сухой йаСВ до 0,15 М (НН4),5О-фракция, 4 4

Эту фракцию наносят на колонку (lpx

100 см) с ДЕАЕ-сефадексом А-50 со скоростью 400 мл/ч, После того, когда выйдет раствор свободного объема колонки (около 3 литров), собирают еще 1,5 литра опалесцирующего раствора и отбрасывают. ДНК-метипазную активность собирают в следующих 5 литрах элюирующего раствора.

Элюат концентрируют высаливанием белков сульфатом аммония до 709o от полного насыщения. Осадок собирают центрифугированием, растворяют в 600 мл

ФЕМ-буфера (20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,0, lмМ ЭДТА; 7 мМ 2-мер- каптоэтанол; -5% глицерин), диализируют против 5 литров ФЕМ-буфера с четырехкратной сменой в течение суток (фрак-. ция 2).

Хроматография на QHK-агарозе. Pacw вор белка после диализа наносят на колонку (5«30 см ) с ДНК-агарозой, уравмывают ФЕМ-буфером, содержащим

0,05 М ИаС1 и колонки разъединяют.

ДНК-метилазу 1 алюируют с фосфоцеллюлозы ФЕМ-буфером, содержащим

0,35 м NaCl со скоростью 30 мл/ч в объеме 60 мл дополнительно KoHUeHT» рируют диализом против двух объемов

70 /о глицерина в ФЕМ-буфере в течение суток. фермент хранят при -20 С.

Применение предлагаемого метода по воляет получить гомогенный фермент и повысить выход в 3,5 раза по сравне-, нию с ранее предложенным способом. формула изобретения

1, Способ получения фермента ДНКцитозин-метилазы 1 из клеток Egcbeva— с9<а С06М Е 600, предусматривающий дезинтеграцию биомассы, центрифугирование гомогената, осаждение из полученного бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот, фракционирование белкового раствора сульфатом аммо ыя, обессоливание фракций, содержащих фермент,, с последующей хроматографией на QEAEсефадексе и стабилизацией готового продукта, отличающийся тем, что, с целью получения гомогенного препарата и увеличения выхода фермента, перед стабилизацией белковый раствор хроматографируют и рехроматографируют на ДНК-агарозе, затем хроматографируют на КМ-целлюлозе и полученный раствор пропускают через последовательно соединенные колонки с Д EA Е-целлюлозой и фосфоцеллюлозой Р li npu атом центрифугирование гомогената осу- ществляют при 10000-30000 ф осаждение нуклеиновых кислот проводят протаминсульфатом, обессоливание фракцией ведут гельфильтрацией на сефадексеЯ-25 а стабилизацию ферментного препарата осуществляют диализом против раствора глицерина.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что осаждение нуклеиновых кислот осуществляется 0,5-0,6%-ным раствором протаминсульфата, 3. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что хроматографию на

ДНК-агарозе ведут в линейном градиенте хлористого натрия от 0,1 до 0,6 М.

4. Способ по и. 1, о т л и ч а ю— ш и -й с я .тем, что рехроматографию на QHK-агарозе ведут в линейном гра5 737443 повешенной ФЕМ-буфером со скростью

60 мл/ч и промывают ФЕМ-буфером, содержащим 0,1 М NQC6 до тех пор, пока оптическая плотность элюата не упадет до нуля. Хроматографию ведут 6 л ФЕМбуфера с линейно повышающейся.конценч рацией ИС1СС от 0,1 до 0,6 М со скоростью 60 мл/ч. Фракции собирают по 20 мл. фермент, элюируют со cpeHHefi KoHUeHTpaцией N(ACE 0,25 М в объеме 600 мл. Фрак-10 ции с активностью ДНК-цитозин-метилазы

1 объединяют и концентрируют ультрафильтрацией в системе Амикон через мембрану

PM-10 до 80 мл и разводят буфером в 2,5 раза до 200 мл (фракция 3).

200 мл фракции 3 наносят на колонку (5х5 см) с ДНК-агарозой, уравновешенной ФЕМ-буфером, содержашим 0,1 MNaCI?, промывают 120 мл этого же буфера и ведут хроматографию 3 л ФЕМ-буфера с линейно повышающейся концентрацией

NaGK от 0,1 до 0,36 М со скоростью

60 мл/ч. фракции собирают по 15 мл, ДНК-цnтозин-метилазу 1 элюируют со средней концентрацией NOCK 0,22 М

25 в объеме 450 мл (фракция 4), фракцию 4 концентрируют на колонке (5xl см) с Wtletrnan P-11 фосфоцеллюлозой; уравновешенной ФЕМ-буфером. Для этого фракцию делят на 4-5 равных частей и каждую часть перед нанесением на колонку разводят в 2,2 раза фЕМ-буфером, нанесение со скоростью

200 мл/час, QHK-метилазу 1 алюируют с колонки ФЕМ-буфером, содержащим 0,35 М 5

NaC1 со скоростью 40 мл/ч, Весь белковый пик с ДНК-цитозин-метилазой 1 выходит в объеме 60 мл. Этот белок диализуют против 5 литров 0,01 М калий

4О фосфатного буфера рН 7,0 в течение 16 ч с двукратной сменой, далее раствор белка наносят на колонку (2,6х10 см) с КМцеллюлозой, уравновешенную диализным буфером, со скоростью 20 мл/ч. Колонку

45 промывают 120 мл этого же буфера со скоростью 30 мл/ч. Хроматографию ведут

750 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера с линейно повышающейся концентрацией NaCl от 0 до 0,1 М со скоростью

30 мл/ч. фракции собирают по 15 мл, 50

Активностью ДНК-цитозин-метилазы 1 обладают фракции со средней концентрацией МаС1,равной 0,05 М в объеме

250 мл (фракция 5)

Фракцию 5 наносят на две последовательно соединенные колонки (5хl см) с ДЕАЕ-целлюлозой и фосфоцеллюлозой со скоростью 120 мл/ч, Колонки про73744

- диейте хлористого на ни от 0,1 до

0,3 М. ,5, Способ по п, 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что хроматографию на

КМ-целлюлозе ведут в линейном градиен те хлористого натрия от 0 до 0,1 М.

6. Способ по п, 1, о т л и ч а ю— ..и и и с я тем, что диализ ведут в те3 8 чение суток против 2-х кратного объема

6096 раствора глицерина в ФЕМ-буфере.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Бурьянов Я. И. Нестеренко В. Ф., Вагабова Л, М. Йоклады Академии Наук

СССР, т, 227, №,6, 1976, с, 1972197 5.

Составитель В. Нестеренко

Редактор Т. Морозова Техред H. Бабурка Корректор И, Муска

Заказ 2602/7 Тираж 522 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретения и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., n, 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4