Способ получения антибиотика

Способ получения антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

! КатЕ:- . « - -/= ти б,-,(„;и-> Ä е..а Ж5А

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советскнк

Социалистических

Республик

<1н738517 (6) ) Дополнительный к патенту (51) И. Ыл. (22) Заявлено 31,0,3,78(21) 2596895/28-13

С 12 D 9/14 (23) Приоритет — (32) 31.03.77

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (31) 35375/77 (33) Япония (53) УДК615. 779. . 931 (088. 8) Опубликовано 30,0580,Бюллетень № 20

Дата опубЛикования описания 05,06,80

Иностранцы

Казухико Окамура, Шой Хирата, Язуши Окумура, Язуо Фукагава, Язутака Шимаучи, Томоюки Ишикура, Кагеаки Коуно (япония) и Йосеф Лайнь (США) (72) Авторы изобретения

Иностранные фирмы Санраку-Оушн КО., ЛТД (Я он я) и Пзнлэбс, Инк (США) (71) Заявители (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Из обрете ние относитс я к области микробиологии и касается получения антибиотиков, обладающих ингибирующим дейс тв ием.

Предложенный антибиотик новый и способ его получения в научно-техни- . ческой и патентной литературе не описан.

Целью изобретения является получение антибиотика общей формулы 10

5-СН С о (1) сн сн

Q GOOK„ где R — водород, металл, алкил или трифенилметил.

Достигается это тем, что штамм

Streptomyces A 271 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, при рН 4,0-9,0 и

20- 40оС с последующим выделением целевого продукта в виде кислоты или в виде сложного эфира, или соли.

Штамм Streptomyces выделен из почвенного образца, собранного недалеко от храма Eiheiji в районе Voshida npeфектуры Fukui в Японии, обозначенный номером A 271.

Культура депонирована в Fermenta=

tion Research institute, Agency of

Jndustriai! Science and Technofogie, где она хранится под номером FERM — Р ,Р 3984 ° Образец организма Streptomyces

А 271 депонирован также институтом

АТСС под Р 31358.

Морфологические признаки. Развет-. вленность полученного мицелия простая, верхняя часть его образует крюки,петли или неполные спирали. Эти формы наблюдаются при культивировании на среде из овсяной муки и глицерин-аспарагиновой агаровой среде, в то вре мя как прямые или же изогнутые формы обычно образуются на среде из дрожжевого и солодового экстрактов.

Форма овальная или цилиндрическая, причем эти споры образуют цепь, состоящую более чем из 10 (обычно 10-50) спор. Размер 0,8-1,0 х 1; 0-1,8 мк, поверхность гладкая, не наблюдается ни жгутиков, ни спорангиев. На воздушном мицелии образуются гифы.

Культуральные признаки штамма

Streptomyces А 271 приведены в табл 1, 738817

Таблица

Цвет воздушного

Рост мицелия

Цвет мицелия-субстрата

Растворимый пигмент

Среда

Светло-оранжево-желтый

Светло-желтый светло-оранжевожелтый

Отсутствует

Бледно-оранжево-желтый до светло-оранжево-желтотого

Светло-желтый

Глюкозо-аспарагиновый агар

То же

То же

Бледно-оранжево-желтый до светло-оранжево-желтого

Светло-желтый до слегка желто-розового

Глицерино-аспарагиновый агар

Светло-ора нжево-желтый до светло-желтого

Б.чедн о- оранжев о-желтый до светло-оранжево-желтого

Агар на ос нов е крахмала и неорганической соли

Бледно-оранжево-желтый до светлз-оранжево-желтого почти не определенный

Св етло-оранжево-желтый до коричневато-желтого бледно-желтый

Тирозиновый агар

Бледно-оранжево-. желтый до светло— оранжево-желтого

Светло-ора нжев о-желтый до бледно-коричневого

Агар из дрожжевого и соло,цового экстракта

Бледно-ора нжевый до светло-оранжево-желтого

Светло-желтый

Агар из овсяной муки

Сахарозо-нитрат- Сильный ный агар

Физиологические характеристики.

Растет и развивается при 10 — 40 С, оптимальной является 20-30 С. Желати0 ну разжижает при 20 С; крахмал гидролизует, молоко пептонизирует, но не коагулирует.

Образует меланоидные пигменты на 40 пирозиновом агаре, на пептоновом дрожжевом железистом агаре и в бульоне ! из триптоно-дрожжевого экстракта. Хорошо усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, рамнозу, плохо усваивает 45 сахарозу. Совсем не усваивает фруктозу, инозитол, раффинозу, маннитол.

Новый антибиотик получают путем инокулирования спор мицелия штамма

Streptomyces A 271 в аэробной питательной среде. В качестве питательной среды используют источники углерода, азота, неорганические соли.

В качеств е источников углерода берут . глюкозу, глицерин, мальтозу, сахарозу, мелассу, декстрин, крахмал, масляные или жировые источники углерода, такие как масло земляных орехов. При неОбходимости добавляют источники азота, пептон, мясной экстракт, муку из соевых бобов, масло из семян хлоп- 60 чатника, сушеные дрожжи, жидкость от замочки кукурузы, дрожжевой экстракт, казеин от снятого молока, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония, неорганические соли; дика- 65 лийфосфат, хлористый натрий, карбонат кальция, сульфат магния, а также следы металлов, например кобальта, марганца.

Для предупреждения вспенивания во время ферментации добавляют антивспениватели, силиконовое и растительное масло..

Среду можно стерилизовать перед культивированием, рН доводят до 4-9, предпочтительно 6-8 до или после стерилизации.

Культивирование проводят в аэробных условиях.

Используют методы встряхивания в колбах или выращивание ведут в погруженном состоянии.

Температура ферментации колеблется от 20 до 400С, предпочтительно от

25 до 35С С . рН культурального бульона во время ферме нтации доводят до 4 — 9, предпочтительно б-8.

Ферментацию ведут до тех пор, пока не сконцентрируется достаточное количество антибиотика. Обычно ферментация длится от 30 до 90 ч, хотя этот период колеблется в зависимости от состава среды, температуры ферментации, штамма. Количество скопившегося антибиотика в Ферментационном бульне определяют биоиспытательным методом и биоавтографией.

/38517

Скопившийся антибиотик растворим в воде и находится в основном вне мицелия, поэтому мицелий удаляют после ферментации изв ест ными способами, фильтрацией, центрифугированием, экстракцией с последующим выделением антибиотика из фильтрата.

Для регенерации и.выделения антибиотика применяют экстрагирование при низком рн с применением растворителя, этилацетата, Н -бутанола или с обрат- О ной экстракцией из слоя растворителя в водный слой при более высоком рН, экстракции при нейтральном рН с применением растворителей; хлористого метилена, хлороформа или в присутствии липофильной четвертичной аммониевой соли, как бензалконийхлорид тетра-н-бутил-аммонийгидросульфат с обратной зкстракцией из слоя растворителя, содержащего йодистый натрий, йодистый калий. 20

Адсорбцию ведут на активированном угле или высокопористых стиролдивинилбензольных смолах, как амберлит и

- элюирование — водным метанолом, вод-. ным ацетоном, гель-фильтрацию — с

25 примеиением сефадекса, хроматографиюна колонне или тонкослойную хроматографию с применением целлюлозы, силикагеля, глинозема, а осаждение путем добавления растворителя — ацетона.

Антибиотик обладает широким спектром антибиотического действия, оказывая сильное действие против различных бактерий, например грам-положительных, таких как Staphylococcus, Dipl î- 35

coccus, Streptococcus, Sarcina, BaciEPus, и грам-отрицательных, относящихся к родам AEcaEigenes, Comamonas, Escherichia, K0ebsieH à, Proteus, Citrobacter, Entегоbacter, Serratia.

Антибиотик обладает свойством повышать антибиотическое действие других антибиотиков, таких как пенициллины и цефалоспорины, а также Citrobacter, frendii, Proteus иКgari s, Entего- ц

bacter aегоgenes, Serratia marcescens.

При введении мышам, зараженным патогенными грам-положительными бактериями, антибиотик оказывает значительное терапевтическое действие. 50

При введении мышам внутрибрюшинным путем в количестве 500 мг/кг антибиотик не оказывает смертельного действия у подопытных животных.

Так как антибиотик более устойчив .в виде соли, чем в виде свободной кис-5 лоты, то в фармацевтических целях его используют предпочтительно в виде соли.

В качестве солей антибиотика используют соли щелочных металлов (нат- 6l рия, калия, лития), щелочноземельных (кальция и магния), а также соли других металлов — алюминия, соль аммония, первичные, вторичные или третич-. ные амины (моноэтиламин, диметиламин, 65 триметиламин, моноэтаноламин, диэта» ноламин), соли с органическими основаниями, как бензатин, прокаин.

Пригодными солями для фармацевтических целей являются соли щелочных металлов, натрия, калия.

Антибиотик представляет собой одноосновную кислоту, содержащую карбоксильную группу в молекуле. Поэтому из антибиотика можно получить различные сложные эфиры с различными спиртами, меркаптанами или их производными; поступают при этом аналогично способу применяемому для известных антибиотиков на основе клавулановой кислоты или тиенамицина.

По изобретению соответствующим сложным эфиром антибиотика является сложный эфир общей структурной формулы сН -СН 3 — СН - СН -NH СО-СН . (II) ссор где R — низкая алкильная группа или трифенильная группа.

B приведенной структурной формуле (II) низшая алкильная группа обозна.чает группу с разветвленной или неразветвленной цепью, в частности алкильную группу с числом атомов С менее б, а именно группу с числом атомов С от 1 до 4. К ней относятся ме- тил, этил, н -пропил, изопропил, н -бутил, изо-бутил, н-пентил, изо-пен тил, н -гексил и др.

С оглас но из об рете нию сложные эфиры приведенной структурной формулы (ХХ) могут быть получены взаимодействием антибиотика структурной формулы (I).èëê его солей с соединенияМи общей структурной формулы (III) где R имеет то же значение, что и выше, а Y — атом или группа, которые можно расщепить.

Что касается атомов или групп, выражаемых символом Y в формуле (III), то применимыми являются, любой вид атомов или групп, которые поддаются расщеплению при контактировании с карбоксильной группой антибиотика„ например атомы галоидов, хлор, бром или йод, сульфонилоксигруппы, карбонилок"игруппы реакционноспособного характера, как -О-СО-CF> и т. и. Предпочтительными являются атомы галоида. .Примерами соединения приведенной структурной формулы (III) являются: метиловый спирт, йодистый метил, диметилсульфат, метилмеркаптан, этанол, бромистый этил, йодистый этил, этилмеркаптан, н -пропилхлорид,. н -пропилйодид, пропиловый спирт,изо-пропиловый спирт,изо-пропилбромид,н -бутиловый спирт, н -бутилбромид; н -бутилйодид, и -пентиловый спирт, н -пентил-1

738517 хлорид, Н -пент. лбромид, Н -пентилйодид, H -гексиловый спирт, н -гексилбромид, H -гe:<ñèëéoäèä, тритиловый спирт, тритилмеркаптан, тритилхлорид, тритилбромид и T. u.

Одним из примеров низших диазоал- 5 канов, пригодных для получения сложных зфиров антибиотика является диазсметан.

Взаимодействие антибиотика с соединениями общей структурной формулы (III) или с низшими диазоалканами мо жет быть осуществлено известными спо собами, применяемыми при этерификации в сложный эфир. Так, например, взаимодействие антибиотика с соедине- 15 ниями общей структурной формулы (III) или с низшими диазоалканами предпочтительно осуществляют в инертной жидкой среце, хотя его можно вести и без нее. B качестве такой среды можно применять углеводороды, как бензол, толуол, )l-гексан, циклогексан и галогензамещенные углеводороды„ как хлороформ, хлористый метилен или другие амиды, как диметилформамид, гексаметилфосфортриамид или другие;,диметилсульфоксид, эфиры, как диэтиловый, диизопропиловый, ди-и-бутиловый, тетрагидрофуран, диоксан или другие, сложные эфиры, как этилацетат, Н -бутилацетат или другие, кетоны, как ацетон, ЗО метилэтилкетон или т. п. Эти растворители можно использовать в отдельности или в виде смесей двух или нескольких из них .

Температура реакции может колебать-35 ся в пределах диапазона в зависимости от рода соединений общей структурной формулы (III), вида низшего диазоалкана рода жидкой среды или использу-! емых продуктов . Температуру реакции QQ можно выбирать в диапазоне, в котором антибиотик не разлагается заметно, однако предпочтительно применяют тем/

С> пературу порядка ниже 60 С, предпоч-.ительно, Π— 40 С, более предпочтитель-45 но, между 5 С и комнатной температурой. При осуществлении этой реакции можно добавлять стимулирующий реакцию реагент, как триметиламин, триэтиламин, пиридин, дициклогексилкар бодиимид, или др. В этих условиях реакция может быть завершена за 1-?4 ч, обычно 3-12 ч.

Согласно предпочтительному варианту изобретения антибиотик, применяемы11 для взаимодействия с реакционноспособным производным структурной формулы III, где R — трифенилметил,, не обязательно должен представлять собой выделенный очищенный продукт. Для реакции может найти применение . куль-40 тивированный продукт или профильтрованный бульон после удаления мицелия из культивированного продукта и сырой препарат антибиотика, частично очищенный регенерацией и выделением 65

К частично очищенным препаратам относятся, например, концентрированный элюат из активиров ан ного угля, которым обрабатывают профильтрованный бульон; концентрированный элюат из стиролдивинилбензольной смолы, как Diaion HP-20, которым обработан профилирова нный бульон, обессоленный концентрат с активированным углем элюата, полученного ступенчатой концентрацией хлористого натрия в фосфатном буфере из ионообменной смолы, например QAE — Sephadex, на котором адсорбирован концентрированный элюат из Diaion НР-20, концентрированный метиленхлоридный экстракт в присутствии бензалконийхлорида, концентрированный экстракт с хлороформом в присутствии crown-соединений; концентрированный бутаноловый экстракт при низком рН (3,5) и низкой температуре.

Полученный таким образом антибиотик-тритиловый сложный эфир выделяют из реакционной смеси и очищают рядом известных способов . По окончании реакции реакционную смесь вначале выливают в водную среду для удаления водных примесей, как побочные продукты и т. д. Предпочтительно в качестве водной среды применяют нейтраль ный буфер, чтобы значение рН приближалось к нейтральному. Антибиотик— тритиловый сложный эфир, экстрагируют малополярным органическим растворителем, в ocHoBHQM не смешивающимся с водой, как этилацетат, бензол, хлороформ и т. п . В течение ступени экстрагирования в целях его улучшения можно добавлять соль: хлористый натрий, сульфат аммония или т, п, По высушивании органического экстракта безводным сульфатом натрия тритиловый сложный эфир выделяют из растворителя известными методами, например гель-фильтрацией с применением продуктов как Bio †Bea S — X3, Sephadex LH-20 или адсорбционной хро. матографией с применением носителей, как силикагель, глинозем, фуллерова земля.

Тритиловый сложный эфир далее очи щают кристаллизацией из растворителя или смеси растворителей, как бензол, толуол, ксилол, этилацетат, диэтиловый эфир, хлористый метилен, хлороформ, гексан, петролейный эфир (кипящий в диапазоне

30-б0 С) .

Среди сложных эфиров общей структурной формулы (III), которые можно пОлучить вышеприведенными способами, антибиотик тритиловы сложный эфир—

738517

10 (П-а) СОΠ— С структурной формулы (П-а) . Н,— CHг 3 — снг- сн -Na- со — снг является одним иэ наиболее полезный, так как он более устойчин по сравнению с антибиотиком структурной формулы (I), его легче выделить, причем он сохраняет сильное антибиотическое действие и ингибирующее р-ëàêòàìàçó действие, в то время как тритиловый 15 сложный эфир известных пенициллинов не оказывает какого-либо ощутимого антибиотического действия. Далее, этот тритиловый сложный эфир структурной формулы (ll-а) очень важен в () качестве одного из активных сложных эфиров и полезного промежуточного продукта для синтезирования других фармацевтических полезных продуктов, поскольку тритиловую группу легко отщепить.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АНТИБИОТИКА,ТРИТИЛОВОГО СЛОЖНОГО ЭФИРА

Тритиловый сложный эфир антибиотика обладает широким спектром антибиотического действия, в частности против ряда различных грам-положительных бактерий родов Dipfococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Sarcina, BaciCEus и тому подобных органиэмов, а также грам-отрицательных бактерий родов ARcaBigenes, Comamonas и т. п.

Тритиловый сложный эфир антибиотика также оказывает хорошее. действие 4О против грам-отрицательных бактерий родов Escherichia, KgebsieGBa, Pro—

t.eus.

Существенной отличительной чертой тритилового сложного эфира антибиоти-45 ка является сильное действие против грам-отрицатель ных бактерий, устойчивых против антибиотиков, обладающих

P-лактамовой кольцевой структурой и относящихся к родам Citrobacter, 5О

Proteus, Enter obacter, К Kebsie 6 B a, Serratia.

Тритиловый сложный эфир антибиотика также обладает свойстном повы.шать антибиотическое действие. других у антибиотиков, н частности р-лактамоных антибиотиков, как пенициллинов и цефалоспоринов, против образующих

Д-лактамазу бектерий, как Citrobacter

f(eundii, proteus часgaris, Entего- . 6О

bacter aегоgenes., Serratia marcescens.

Тритиловый сложный .эфир антибиотика при введении мышам, зараженным патогенными грам-положительными бактери ями, оказывает значительное терапевтическое действие.

Тритиловый сложный эфир при введении внутрибрюшинньм путем мышам в количестве 500 мг/кг не вызывает смеРти подопытных животных.

Антибиотик и его производные, в частности тритиловый сложный эфир, оказывают в пробирке и на живом органиэме действие на грам-отрицательные и грам-положительные микроорганизмы и вследствие этого полезны при борьбе с бактериальными инфекциями и их предупреждении в организмах подопытных животных.

Антибиотик или его тритиловый сложный эфир и соответствующие составы могут быть введены орально, местно или парентерально (внутриненно, внутримышечно, ннутрибрюшинно и т. д.) и могут найти применение в целом ряде различньж фармацентических препа ратов в зависимости .от способа введе ния. Так, например, антибиотик или его тритиловый сложный эфир можно сочетать с фармакологически совмести,мым носителем, раэбавителем н твердом ниде (например B виде таблеток, кап, сул, порошков, гранул, покрытых сахаром таблеток, лепешек, порошков для распыления, суппозиториев и т. д.), в полутвердом виде (например в виде мазей, кремов, полутвердых капсул и, так далее), в жидком виде (например, в виде жидких растворов, эмульсий, вэнесей, лосьонов, сиропов, растворов для инъецирования, жидких растворов ,цля распыления и т. д.) .

Ециничная доза, содержащая антибиотик, или его тритиловый сложный эфир, может содержать 0,1-99% по весу актив ного компонента в любом ниде; жидком, полужидком и твердом.

Таблетки и капсулы для орального. введения могут быть получены в виде единичных доз и содержать связывающие агенты, например сироп, аравийскую камедь, желатину, сорбитол, трига— кант, полининилпирролидон, или наполнители, например лактозу, сахарозу,. крахмал, фосфат кальция, сорбитол, глицин или смазывающие агенты, например стеарат магния, полиэтиленгликоль, тальк, кремнезем или другие; агенты распада, например картофельный крахмалг смачивающие агенты — лаурилсульфат натрия или др. Таблетки могут быть покрыты в соответствии с общеизвестными методами. жидкие препараты могут быть получены для орального введения в виде масляных или водных суспенэий, растнорон, эмульсий, сиропов и так далее, или же их можно изготавливать в виде сухих проДуктов, которые разбавляют водой или другими соответствующими носителями перед внедением. Вышеприведенные жидкие препараты для орального введения могут содержать следующие фармацевтически совместимые

738517

В случае использования антибиоти= ка и/или его тритилового сложного эфира для лечения инфекций в организме свиней, коров, овец, кур препаратЫ могут быть получены в виде средств, расположенных внутри молочной железы на основе веществ замедленного или скорого действия, например н виде концентратов для добавления в корм., Фармацевтические составы согласно изобретению могут содержать антибио>ик или его тритиловый сложный эфир

60 ингредиенты; суспендирующие ингредиенты (например, метилцеллюлозу, сорбитоловый сироп, сахарный сироп, оксиэтилцеллюлозу, желатину, карбсксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия, гидрогенированные съедобные жиры и масла), ненодные носители (например, этиловый спирт, пропиленгликоль, маслянистые сложные эфиры, фракционированное масло кокосового ореха, миндальное масло); эмульгирующие агенты (например, лецитин íà основе аравийской камеди, сорбитановый моноолеат); консервирующие средства (например, метил-п-оксибензоат, пропил-П-оксибензоат, сорбиновую кислоту) .

Суппозитории могут содержать обычные or.новные продукты для этих средств, как масло какао и различные глицериды.

Инъекционные составы могут быть получены в виде единичных доз в ампу- 20 лax или многодозовых емкостях с содер>ка н ием к о нс ерв ирующег о с редс тв а . Они могут иметь форму суспензий, раство ров и эмульсий в маслянистых или водных носителях, а в соответствующем 25 случае могут содержать суспендирующие или диспергирующие агенты и стабилизаторы. Антибиотик может быть получен в виде порошка, который можно комбинировать с непирогенной стериль- 3() ной водой перед применением.

Cocтавы, содержащие антибиотик или его тритиловый сложный эфир, могут быть получены в различных формах, пригодных для адсорбции через слизис- З5 тую оболочку носа, горла, а также бронхов. Так, например, для этой цели предпочтительными являются порошки или жидкие растворы для распыления, ингаляционные препараты, лепешки, полоскания для горла и так далее.

Для лечения глаз и ушей антибиотик изготавливают в виде отдельных капсул ,-.,ля ввода по каплям н жидком или полужидком виде. Для местного применения пригодны препараты на гидрофобной или гидрофильной основах, как порошки, лосьоны, кремы, мази.

Составы могут содержать ингреди-, енты, например, консервирующие, противоокислительные, смазывающие, при- 50 дающие вязкость, ароматизирующие, суспендирующие, связующие, стабилизующие продукты. в виде единственного активного ингредиента или же в сочетании с иными терапевтически действенными ингредиентами.

Так как антибиотик и его тритиловый сложный эфир обладают синергистическим действием на различных образующих Р -лактамазу бактерий в сочетании c P> -лактамовыми соединениями, их целесообразно комбинировать в фармацевтических составах с р -лактамовыми соединениями. В качестве подходящего р -лактамавого соединения используют бензилпенициллин, феноксипенициллин, карбенициллин, ампициллин и амоксициллин; а также производные цефалоспорина, как цефалоридин, цефалотин, цефазолин, цефалексин, цефокситин, цефацетрил, цефамондол, цефапирин, цефрадин и цефалоглицин.

Применяют антибиотик и известные

PJ лактамоные соединения в соотношениях от 20:1 до 1:150, предпочтительно, от 10:1 до 1:100.

При лечении бактериальных инфекций у млекопитающих количество антибиотика его тритилового сложного эфира можно изменять н зависимости от объекта лечения, веса тела, типа, серьезности и симптомов инфекции, способа и количества введений. При обыкновенном оральном или парентеральном введении целесообразной является суточная доза 0,05-500 мг/кг, предпочтительно

0,5 †2 мг/кг, более предпочтительно в виде частичных доз. Дозы нне приведенного диапазона также могут быть применены в зависимости от индивидуальных условий подвергаемого лечению организма.

Антибиотик или его тритиловый сложный эфир может найти применение не только в фармацевтическихсоставах, а также может быть добавлен в виде концентрата или же непосредственно в корм. Дополнительно его можно использонать в качестве активного ингредиента для консервирования кормов или их дезинфекции.

Во всех примерах качественные и количественные опыты на противомикробное действие основаны на следующей методике.

Биоиспытание на противомикробное действ ие .

Полученную за ночь куль туру

Cornainonas сerrigena В-996 на косом питательном агаре взвешивают в питательном бульоне с целью достижения оптической плотности клеток порядка

0,040 при 610 нм.

Пссевную взвесь добавляют в количестве 1% в расплавленную агаровую среду, ссдержащую 0,8% питательного бульонного порошка (Kyokuto Nutrient

Broth Powder) и 1% Bacto — Agar. 7 мл засеянной расплавленной агаровой среды распределяют в чашке Петри

14

13

738517 диаметром 9 см и дают отвердеть. По лучают пластину типа Comamonas.

Организм Staphy(, ococcus aureus

FDA 209 P культивируют за ночь в питательном бульоне со встряхиванием, разбавляя 50 раэ питательным бульоном для получения посевной взвеси, 1% по объему этой взвеси тщательно смешивают с расплавленной агаровой средой, содержащей 1Ъ Kyokuto Nutrient

Broth Powder и 1% Bacto-Agar 7 мл, каждой иэ засеянной расплавленной агаровой среды вливают с гелеобразованием в.чашку Петри диаметром 9 см.

Эту пластину обозначают биопластиной типа Staphyg ococcus.

Аналогично получают биопластину типа Afcaligenes. Полученную эа ночь питательную культуру на косом агаре организма A(ca(!igenes faecafis В-326 взвешивают в питательном бульоне, получая суспенэию из семян, концент- 2() рацию клеток которой доводят до оптической плотности 0,020 при 610 нм.

Агаровую среду, состоящую из 0,5% .Kyokuto Nutrient Broth Powder и 1Ъ

Bacto Agar, расплавляют при допустимой температуре и засевают 1,0% прививочного материала посевной суспензии. 7 мл засеянной расплавленной агаровой среды распределяют в чашке Петри диаметром 9 см и дают образоваться гелю. Эту пластину называют биопластиной типа ACca(.igenes.

Пульповый кружок (8 мм) -обычным способом пропитывают раствором испытуемого образца, выдерживают на чистом листе фильтровальной бумаги в течение времени, достаточного для удаления избыточного раствора и затем переносят на биоиспытательную пластину. После инкубации при 35 С в течение 20 ч эамерякт диаметр образовавшейся зоны ингибирования и сравнивают со стандартными растворами цефалоридина. Антимикробное действие антибиотика и родственных соединений выражают в виде единиц цефалоридинового эквивалента на мл.

В частности, раствор антибиотика и родственных соединений согласно изОбретению, показывающий тот же диаметр зоны ингибирования, как 100 мг/мхБО .цефалоридина, выражают, как 100 цефа.лоридиновых единиц/мл. Аналогично, если твердый образец антибиотика и родственных соединений согласно изобретению дает при концентрации 1 мг/мл 55 тот же диаметр„ как 1 мг/мл цефалори- дина, специфическая активность твердого образца будет выражена, как 1 цефалоридиновая единица на мг. Стандартная кривая биологического опыта немно-6О

1 го изменяется в зависимости от рода испытуемого организма. Для обозначения подопытных микроорганизмов применящт следующие названия — сокращения:

Comamonas цефалоридиновая единица (CCV), Staphylococcus — цефалоридино2.0

1,0

0,1

0,00013 вая единица (SCV); A(,ca(.igenes — цефалоридиновая единица (ACV) .

Биоавтография. Изготавливают большую биоиспытательную пластину за исключением того, что 100 мл засеянной расплавленной агаровой среды вливают в прямоугольную чашку 32 х 24 СМ, а не в чашку Петри (9 см) .

Подлежащую биоиспытанию бумажную хроматограмму помещают на 15 мин на зту большую испытательную пластину.

По удалении бумаги испытательную пласо тину инкубируют 20 ч при 35 С в целях обнаружения зон ингибирования. Эта техника позволяет не только вычитывать значение (я) Rf (качественное испытание), то также и определить антимикробное действие, основываясь на размерах зоны ингибирования.

В случае применения пластины для тонкослойной хроматографии между ней

1 и поверхностью испытательной пластины помещают тонкую бумагу. Аналогичный способ применяют для качественного и полуколичественного биологических испытаний.

Пример 1. Колбу Эрленмайера емкостью 500 мл, содержащую посевную культуральную среду, стерилизуют при

120 С в течение 15 мин. К богатой спорами косой культуре организма Streptornvces А 271 добавляют 10 мл 0,023

tween-80, после чего смесь слегка перемешивают, получая суспензию спор.

Колбу Эрленмайера емкостью 500 мл инокулируют 1 мл споровой суспенэии, встряхивая затем в целях культивирования 48 ч при 28 С на ротационном вибраторе. Затем 2 мл посевной культуры инокулируют в каждую из 6 колб Эрленмайера, из которых каждая содержит

100 мл описанной среды, после чего 4896 ч культивируют, встряхивая при

28 С на ротационном вибраторе.

Среда посевной культуры, вес.оо

Мясной экстракт 0,3

Bacto- гур опе 0,5

Глюкоза 0,1

Крахмал растворимый 2,4

Дрожжевой экстракт 0.,5

Карбонат кальция 0,4

Обезжиренная соевая мука 0,5 рН перед стерилизацией 7;5; после стерилизации 7,1; через 2 дня ферментации — 7,4.

Производственная среда, вес.Ъ

Среда AG-1

1 люкоза 1,5

Крахмал кукурузный 2,5

Жидкость от. замочки кукурузы

Сухие дрожжи

Метионин

СоСО - 6Н О рН перед стерилизацией 7,2," после стерилизации — 6,1; через 4 дня ферментации — 7,8.

738517

ACU/m

Medium

105

420

AG-1

AGA-2

AGB-1

420

340

105

0 9

185

AGB-41

ML-19

AG0-1

8,9

440

3,0

1,0

122

1,4

0 9

340

0,0001

6,5; после сте4 дня фермента20

5,0

1,0

0,3

2,5

0.,5

0,05

0,05

0,3

0,00013 ,Оу после сте- 0 дня ферментаТаблица 3

1, 000

500

500

50

50

50

50

150

270

850

870

10

300

270

12

230

13

200

50

170

125

Среда, АСА-2 вес. Ъ;

Глюкоза

Ц

Крахмал картофельный 2,5

Жидкость от замочки кукурузы 2,0

С ух и е дрожжи 1,0

СоСВ ° 6Н О 0,00013 рН перед стерилизацией 6,5; после стерилизации — 5,8; через 4 дня ферментации 7,8.

Среда AGB — 1, вес.Ъ

Мальтоза

Сухие дрожжи

Жидкость от замочки кукурузы

СосЪ . 6Н О рН перед стерилизацией рилизации — 5,9; через ции 7,9.

Среда AGB-41, вес . Ъ

Мальто за

Крахмал картофельный

Глицерин

Дрожжи сухие

Хлористый натрий

К2НРО„

MgSO4 7Н О

СаСО>

Сосб 6Н О рН перед стерилизацией 7 рилизации — 6,9; через 4 ии 7, 9.

Среда ML-19, вес.Ъ

Глицерин 4.,0 35

Пептон 0,5

Глюкоза 0,2

Крахмал картофельный 0,2

Соевая мука обезжиренна я 0„5 40

Др ожжи с оевые 0,5

Хлористый натрий 0,5

Сасо 0,2 рН перед стерилизацией 6,4; после стерилизации — 7,0; после 4 дней фермен- 45 тации — 7,0. . Среда AG0-1, вес. Ъ

Соевое масло 3,0

Дрожжи сухие 2,0

Хлористый натрий 0,5

К2 НР04 0,05

MgSO4 - 7Н20 0,05

СаСО 0,3

СоСЕ бН О 0,00013

2 рН перед стерилизацией 7,0; после стерилизации — 7,2; через 4 дня ферментацин -- 7,1.

Антибиологическое действие бульонного фильтрата определяют испытанием с применением пластин и организмов Соmamonas terrigena В-996, StaphyCococ- 60

cu s aureus 20 9Р, А(са Гigenes f aec а 0is

B-32б, Результаты, полученные через 72 ч после инокулирования, приведены в табл. 2.

Т à 6 л и ц а 2

Антибиологическое действие

Пример 2. Получение концентрированного элюата антибиотика РЯ-5.

Аналогично примеру 1 15 л среды

ML-19 ферментируют 72 ч в 150 колбах.

К собранному бульону добавляют 100 мг динатрийэтилендиаминтетраацетата и

2Ъ по весу Торсо PerCite, Topco М 34, после чего фильтруют через болыаую воронку Бухнера, получая 14,1 л бульоннбго фильтрата (рН 7,9) . Продукт загружают на колонну (DIAION) HP 20, 7 х 50.см, высокопористый стиролполивинилбенэоловый сополимер в виде псевдоожиженного слоя с крупносетчатой с.труктурой, промывают 7 л дистиллированной воды и элюируют 50Ъ по объему метанола.

Характеристики элюирования отно=ительно антибиотичного действия приведены в табл. 3. Загрузка 40 С< U/ìë х х. 14,000 мл.

17

18

738517

Продолжение табл. 3

2 5

105

17

50

75

19

50

50

38

22

50

50

50

10

26

27

28

29 рН

Остаточная активность, ф

3,0

4i0

5,0

9,0

6,0

79,0

76,5

7,0

8,0

88,5

9,0 82,0

Эти результаты показывают, что полученный в настоящем примере желтоваЭлюаты 99 8-14 соединяют, концентрируют до 100 мл при температуре ниже 30 С на ротационном выпарном аппарате и затем сушат замораживанием с получением 2,6 r желтовато-коричневого порошка. Этот порошок растворяют в дистиллированной воде с концентрацией 500 CCU/ìë.

Растворы на основе фосфатного буфера заданных рН получают доведением

15 М дикалийфосфата до необходимого значения с помощью 5 н. гидроокиси натрия или 5 н. фосфорной кислоты.

В 1 мл раствора антибиотика добавляют 1 мл фосфатного буфера и значение рН доводят до первоначального. Растворы антибиотика с изменением рН выдерживают 30 мин при 60 С в водяной бане, охлаждают под проточной водой и нейтрализуют до рН 7,0 небольшим количеством 5 н. гидроокиси натрия или 5 н. фосфорной кислоты. Контрольную трубку, содержащую раствор антибиотика РБ-5 с рН 7,0 помещают на ледяную баню на полчаса. Остаточную антимикробную активность замеряют описанным способом с применением в качестве подопытного микроорганизма

Comamonas terrigena В-996. токоричневый порошок заметно стабилен при рН диапазона 6,9-9,0 в течение 30 мин при 60 С.устойчивость айтибиотика повышается при более низких температурах даже при кислом рН. Так, например, после обработки антибиотика при рН 3,0 в течение " мин при

-17 C по меньшей мере ЗОЪ первоначального антибиотического действия еще можно установить.

Пример 3. Экстракция при низкой температуре н -бутанолом.

Большую испытательную трубку, содержащую 20 мл дистиллированной воды, 12 мл н-бутанола и 7 г хлористого натрия, охлаждают до -17 С без замораживания. Желтовато-коричневый пороItIoK антибиотика, полученный B примере

2, разбавляют до концентрации 200 мг/мл в дистиллированной воде и предварительно заморажиьают, 1 мл холодного раст20 вора антибиотика добавляют в эту испытательную трубку, быстро доводят рН до 2,75, 3, О или 3,25 с помощью серной кислоты и выдерживая температуру смеси ниже — 10 С . После тщатель25 ного перемешивания регенерируют

-бутаноловый слой и тщательно смешивают с 5 мл 0,5 М (рН 6,8), перенося активный компонент в водный слой.

Пример 4. Получение порошка .

gQ аналогично примеру 2 из 100 л бульонного фильтрата после сушки замораживанием получают 27,7 г желтовато-коричневого порошка антибиотика. Этот порошок (активность 13, 2 CCU/Mr) растворяют в 30 мл ?5 М фосфатного буфера (рН 6,8) и помещают на колонну из

QAE — Sephadex Ь-25 основная анионнообменная смола, полностью переведенная в четвертичное соединение, полученная вводом диэтил-2-оксипропилам-. мониевых групп в декстрановый гель; (3,3 х 25,0 см) . После промывки небольшим количеством того же фосфатного буфера активную фракцию элюируют тем же буфером, содержащим хлористый натрий в концентрации 0,5 М в хоце элюирования. Активную фракцию (300 мл) охлаждают до О C и обрабатывают 6 г активного угля. Активный уголь собирают, промывают водой и элюируют 50% IIQ

50 объему ацетона. По удалении, ацетона выпаркой при температуре ниже 30 С

727 мг коричневато-желтого порошка натриевой соли антибиотика регенерируют лиофилизацией.

55 Удельная активность препарата

264 CCU/ìr.

Пример 5. .Получение порошковой дэаэ-целлюлозы.

727 г полученного в примере 4, коричневато-желтого порошка антибиотика растворяют в 1 мл 25 М фосфатного буфера (pH 6,8) и загружают на колонну (1,5 х 27,0 см) из В10-Гее Р— 2 (поперечно сшитый синтетический сополимерный состав в виде катализирующего!

738517 слоя на основе метилен.-бис-акриламид ного сополимера, уравнонешенногс тем же фосфатным буфером. Проявляя тем же самым фосфатным буфером, получают активную фракцию в количестве 15 мл.

Полученную активную фракцию поме- 5 щают на колонну (2,5 х 28,0 см) из диэтиленминоэтиловой (ДЭАЭ) целлюлозы DE 32, уравновешенной тем же самым фосфатным буфером. Элюирование осуществляют линейным градиентом хлористого натрия н том же фосфатном буфере (0-0,5 М) . Полученную активную фракцию (240 мл) адсорбируют на 4,5 г активного угля,при О С. Активный уголь собирают фильтрацией, промывают водой и элюируют 50Ъ по объему ацетона. Ацетонный элюат выпаривают при температуре ниже 30 С до полного удаления ацетона, лиофилизируя затем с получением

120 мг коричневато-белого порошка натриеной соли антибиотика PS-5. Удельная активность этого препарата составляеr 600 CCU/мг.

Пример 6. Высокоочищенный препарат антибиотика.

Аналогично примеру 1 организм 2S

StrBptomgces A 271 культивируют в колбе Эрленмайера емкостью 500 мл, содержащей 100 мл среды SE-4 инокулируя затем в 30-литровый фермента ор, содержащий 15 л среды SE-4. Куль- 30 тинирование продолжают 24 ч при 28 С и 200 об/мин с принудительной аэрацией н объеме 7,5 л/мин, получая культуру семян.

2 емкости для ферментации емкостью Я в 200 л, выполненные из нержавеющей

"тали, наполняют каждый 200 л среды

YiL-19, содержащей 2,5% обезжиренной соевой муки, затем обрабатывают в авт.>клане, инокулирую