Штамм вкмв 548-продуцент фермента глутаминазыаспарагиназы

Штамм вкмв 548-продуцент фермента глутаминазыаспарагиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскик

Соцналистическиз

Республик пц 739096

К АВТОРСКОМУ СВНДН ЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 281177 (21) . 2547431/28-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 0506.80. Бюллетень Ио 21

Дата опубликования описания 050680

С 12 К 1/02

С 12 D 1)/10

Государственный номнтет

СССР по делам нзобретеннй н отнрытнй (53) УДК576.852. 15 (088.8) (72) Авторы изобретения

Т.Т. Березов, В.A. Занин и И.H. Смирнова (71) Заявители (5 4) ШТАММ PSEUDONONAS AUBANT1ACA ВКМВ 5 48

ПРОДУЦЕНТ ФЕРМЕНТА ГЛУТАМИН ЗН-АСПАРАГИНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологическому производству глутаминазы-аспарагин азы и может быть применено в микробиологии, медицине, фермент ной медицинской промышленности

Одной иэ основных проблем современной медицины является поиск новых лечебных препаратов, обладающих противоопухолевой активностью. Перспективными являются поиски препаратов микробного происхождения.

Известно, что фермент глутаминаэа-аспарагинаэа. (KC 3.5.1.38) в отличие от других дезамидаз катализирует гидролиэ как L-глутамина, так и L-аспарагина, способен подавлять рост некоторых опухолей, устойчивых к действию — аспарагиназ, Известен штамм Pseudomonas f uorescens, а также ряд других культур продуцирующих глутаминазу-аспарагинаэу. Однако их недостатком является невысокая активность образуемых ферментови).

Наиболее близким по технической сущности к эаявленноМУ является штамм Pseudomonas Ьогеорот1я 526/i@.

Недостатком этого штамма также является недостаточно высокая актив ность глутаминазы-аспарагиназы в срав. нительно длинный цикл развития теро«« дуцента (22-24 часа) .

Целью настоящего изобретения является штамч того же рода Pseudoтопая, синтезирующий высокоактивные внутриклеточные ферменты и отвечающий требованиям, предъявляем м к про дуцинту °

Предлагаемый штамм хранится в коллекции культуо микроорганизмов института микробиологии АН СССР под номером ВК NB 548.

Штамм Pseudomonas aurant1aca

15 ВКМВ 548 — продуцент глутакинаэыаспарагинаэы на агаризованиой среде (МПА с 13 глюкозы) образует колонии оранжевого или красно-желтого цвета, гладкие, блестящие, плоские и -вы20 пуклые. Пигмент выделяется в среду, окрашивая ее в зеленовато-красный флюоресцирующий цвет. Клетки в молодых культурах палочковидные, средниМ размеров 2-3 х 0,6 нм, подвижные, имеют на конце 2-5 жгутиков.

Штамм хорошо растет на МПБ с 1й глюкозы, усваивает минеральный азот так же хорошо, как и органический.

Иэ источников углерода хорошо усва30 ивает глюкозу, глицерин. АспарагиноМосковский ордена Ленина и ордена Трудового

Красного Знамени государственный Университет им. М. В. Ломоносова и Ордена Дружбы университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы

739096

Образует красно-оранжевый пигмент, растворимый в спирте и в воде. Оптимальная реакция среды 7,2-7, 4. Может

pas виват ься и при рН 7, 6-7, 8.

При сравнении C известным штаммом Pseudomonas boreopo is 526 предлагаемяй штамм имеет следующие величины глутаминаэной и аспаразинаэной активностей.

Сравнительные данные активностей известного и предложенного штаммов (МПБ с 1% глюкозы) Наименование штамма

Время

0,95 О, 48 Оу 86

1,52 2, 36 1,41

Как видно иэ таблицы, предлагаемый 25 штамм Pseudomonas aurantiaca 548 отличается более высокой глутаминазной и аспарагинаэной активностями и образованием максимального количества фермента в более ранний срок 30 культивирования (18 час), по сравнению с известным штаммом (23-24 часа) .

Пример. Штамм Pseudomonas

aurant1aca BKMB 548, выросший на среде известного состава, содержащей 35

МПА с 1% глюкозы, вносят с помощью бактериальной петли в посевную среду того же состава и культивируют глубинным способом при рН 7,2-7,4 в течение 18 часов при рН 7, 2-7, 4 при

28-29 в качалочных колбах емкостью

250 мл (объем среды 100 мл) . Затем посевной материал в количестве 5% вносят в среду того же состава и выращивают тем же способом в течение

18 часов. 45

Пример. Штамм Pseudomonas

aurantiaca BKNB 548, выросший на среде известного состава, содержащей

МПА с 1% глюкозы, вносят с помощью бактериальной петли в посевную не- Я агаризованную среду того же состава и культивируЮт глубинным способом при рН 7,2-7,4 в течение 18 часов при температуре — 28-29 С в качалочных колбах емкостью 250 мл (объем 55 среды 100 мл) . Затем посевной материал в количестве 5% вносят в среду известного состава, содержащую (г/л) — при 5-6 тыс. об/мин (10-15 минут) глут амат натрия — 20, КН РΠ— 13, 6 ?

NgSOa -7Н О вЂ” О, 2; FeCg 6Н О вЂ” 0,6) 60

МпСО< 4Н О вЂ” 0,6; БпС1 — 0,6;

CuSO< 5Н О вЂ” 0,6; CaCC 2Í Î вЂ” 0,6;

NaCt, — 0,6; рН 7,2-7,4 и выращивают тем же способом в течение 18 часов при температуре 28-29 С. 45

Формула изобретения вую и глутаминовую кислоты использует в качестве углерода и азота, Агар не разжижает, желатину разжижает энергично, молоко не свертывает, но пептониэирует, нитраты не восстанавливает, крахмал не разлагает. Азроб; оптимум температуры 28ю.

29 С, хорошо растет и при температ?— ре 25-27 С.

Pseudomonas boreopot is

526 (известный штамм) О, 48

Pseudomonas aurantiaca 548 (предложенный штамм 2,60

Биомассу отделяют от культурал ьной жидкости центрифугированием при

5-6 тыс. oe /Mèí (10/15 минут), промывают холодной водопроводной водой (2 раза) и осадок переносят в ступки в небольшом количестве трис буфера (pH 7, 2) (1-2 мл), тщательно размешивают и эамораживают при температуре — 10 в течение суток, Затем замерзшую биомассу разрушают растиранием в ступке, разводят гомогенат;

2 мл трис буфера и центрифугируют

10 минут при 8 тыс. об/мин.

Содержание белка в пробе определяют по Лоури. Затем определяют активность фермента, используя в качест ве субстратов глутамин и аспарагин (27 мкмоль/мл) и измеряя концентрацию NH д колориметрически с реактивом Несслера. удельную активность фермента выражали в мкмолях NH>, выделившегося за 1 минуту на 1 мг белка.

Использование предлагаемого шгамма по сравнению с известными культурами имеет следующие преимушества: короткий цикл развития продуцента и увеличение глутаминазной и аспарагинаэной активностей (см.табл ° ) .

Шгамм Pseudomonas aurantiaca

ВКМВ -548-нродуцеит фермента глутаминазы-аспарагиназы, хранит ся в коллекции культур микроорганизмов института микробиологии AH СССР, Морфологические признаки. Клетки в ьюлодых культурах палочковидные, средних размеров 2-3 х 0,6 нм, подвижные, имеют на конце 2-5 жгутиков.

739096

Составитель Н. Паников

Редактор О. Иванова Техред Н.Бабурка Корректор М, шароши

Заказ 2777/24

Тираж 522 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Фияиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,4

Физиологические признаки. На

МПА с 1% глюкозой образует колонии оранжевого или красно-желтого цвета, гладкие, блестящие, плоские и выпуклые. Пигмент проникает в субстрат, окрашивает его в зеленоватокрасный флюоресцирующий цвет, Колонии плохо снимают ся петлей.

На МПБ с 1% глюкозой дает также хороший рост с образованием краснокоричневого пигмента.

На синтетической среде с глутаматом натрия рост хороший. Среда окрашена в розово-желтый цвет.

Отношение к углеводам. Хорошо усваивает глюкозу, фруктозу, мальтозу, лактозу, ксилоэу, арабинозу, рам15 нову, галактоэу °

Отношение к органическим кислотам.

Усваивает сукцинат, лактат, цитрат, глут амат, э спарт ат °

Отношение к азотистым веществам.

Усваивает минеральный азот так же хорошо, как и органический.

Агар разжижает, желатину разжижает энергично, молоко не свертывает, не пептониэирует. Нитраты не восстанавливает, крахмал не разлагает.

Образует красно-оранжевый пигмент, растворимый в спирте и в воде. Аэроб, оптимум температуры роста — 28-29 С.

Фермент глутаминаэа-аспарагиназа внутриклеточный.

Глутаминаэная активность штамма

Pseudomonas aurantiaca ВКМВ 548 иа сложной среде (МПБ с 1% глюкозы) составляет 5-6 МЕ/мг, на синтетической среде с глутаматом натрия — 3-5 МЕ/мг.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. С.P. Мардашев, A.Я. Николаев, Н.В. Коваленко, С.С. Раков, Т.A. Цветкова, 1975. Вопросы медицинской химии, ХХI, вып. 1, стр. 29.

2. И.П. Смирнова, A В. Занин, Т.Т, Березов, 1976. Прикладная биохимия и микробиология, XII вып.1, СТр. 14 — TIpOTOTHTI