Питательная среда для селекции этанол-усваивающих микроорганизмов

Питательная среда для селекции этанол-усваивающих микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

739103

Союз Советских

Соцкалнсткческих

Республик

ОП :

M3GSPe e Не

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ с

j (6l ) Дополнительное к авт. свил-ву — (22) Заявлено 30.01.78 (21) 2574877/28-13 (51 ) М. Кл.

С 12 К 1/06 с присоединением заявки ¹

Государстееиный комитет (28) Приоритет по делам изобретений и открытий

Опубликовано 05.06.80

Лата олуб IHKDBBHNB OIIHCHIIHII 01.06.80. (72) Авторы изобретения

С. П. Коваленко, О. Н. Замбржицкий и В. С. Шевчук

Институт микробиологии АН Белорусской CCP (7I) Заявитель (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ

ЭТАНОЛ-УС ВАИВАЮЩИХ

МИКРООРГАНИЗМОВ и трудоемкость этих испытаний являются серьезными недостатками, устраняемыми лишь в тех редких с»учаях когда возможно применение селективных питательных сред на этапе клонирования.

Известна питательная среда для выращивания этанол- усваивающих микроорганизмов, содержащая этанол в ка естве единственного источника углерода. источники других элементов, в частности, калий фосфорнокислый однозамещепный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, а также агар, мочевину и воду (1).

Однако использование этой питательной среды в селекции зтапол-усваивающих микроорганизмов не позволяет достаточно эффективно находить наиболее быстро растущие мутантные формы по указанным причинам.

Целью изобретения является ускорение процесса селекции и обеспечение возможности отбора »а»более быстро растущих мутантов этанолусваивающих микроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, включающая этанол как единИзобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для селекционного улучшения продуцентов кормового белка.

Одним из путей повышения продуктивности

5 микрооргатизмов является увеличение скорости их роста. Селекция микроорганизмов, направленная на увеличение скорости роста, как и любая другая селекция по количественным признакам, представляет собой трудоемкий и дли1О тельный процесс. Первым этапом этого процесса является выращивание селектируемой культуры на плотной среде, которая позволяет расти всем жизнеспособным особам данного микроорганизм;., Отбор более продуктивных

15 мутантов выло»пяется только на втором этапе, заключакипемся в индивидуальном испытании каждого клона по селектируемому признаку.

Несмотря на предварительное воздействие на исх,1,. ьш микроорганизм высокоактивных мутагенов, более продуктивные мутанты встречаются очень редко, их колонии внешне ничем не отличаются, а поэтому для их поиска испытанию подвергаются сотни клонов. Длительность

Бюллетень № 21 . (53) УДК 663 1 (088.8) 10

Таблица 1

Удельная скорость роста

Активность АДГ

Исследуемый штамм

1 ч

% от активности исходной культуры

%отм. исходной культуры единиц мг белка

2,20 + 0,08

149,7

0,39 + 0,018

150,0

Мутант 5

1,87 + 0,11

127,2

142,3

1,84 + 0,15

125,2

0,35 + 0,021

0,26 + 0,003

130,8

Мутант 14

1,47 + 0,10

100,0

Исходный

3 739103 ственный источник углерода, необходимые минеральные соли и агар, дополнительно содержит иодуксусную кислоту (ИУК) в качестве . ингибитора алкогольдегидрогеназы (АДГ) в концентрации, достаточной для торможения роста исходного микроорганизма. Входящие в питательную среду компоненты находятся в следующем соотношении, вес.%:

Этанол 0,7-1,5

Калий фосфорнокислый одно замещенный 0,25 — 0,3

Натрий фосфорпокислый двузамещенный 0,5 — О,б

Магний сернокислый 0,1 — 0,13

Мочевина 0,19 — 0,34

Иодуксусная кислота 0,1 — 0,8

Агар 1,5-2,0

Вода Остальное

Предлагаемая среда является селективной и способствует росту только тех клонов исходного микроорганизма, которые обладают повышенными скоростями роста по сравнению с основной массой клеточной популяции.

Введение в среду иодуксусной кислоты в качестве селектирующего агента обусловлено следующими теоретическими предпосылками.

К увеличению скорости роста микроорганизмов на этанол-содержащих средах должны проводить мутации, способствующие повышению продукции ю

Мутант 11 0,37 + 0,013

Готовят предложенную питательную среду следуюгцим образом.

Входящие в ее состав компоненты, вес.%:

К% "04 0,25 — 0,3

Na НРО 12Н О 0,5 — 0,6

MgSGä" 7Н О 0,1 — 0,13

Мочевину 0,19 — 0,34

Иодуксусную кислоту 0,1-0,8 растворяют в необходимом количестве водопроводной воды, нейтрализуют с помощью

Na0H до рК 7,0, добавляют 1,5 — 2,0 вес.%

4 ферментов, катализирующих процессы превращения этанола в органические компоненты клеток, и в первую очередь алкогольдегидрогеназы (АДГ) первого фермента этой цепи процессов.

Известно, что иодуксусная кислота является сильным ингибитором АДГ, связываясь с сульфгидрильными группами активного центра этого фермента. Действие иодуксусной кислоты, в отличие от ее производных (эфиров, амида), достаточно специфично, т.е. кроме АДГ, эта кислота действует еще на один фермент (участвующий в процессах усвоения сахаров). На среде, единственным источником утлерода в которой является этанол, в присутствии иодуксусной кислоты могут расти лишь такие мутанты, которые производят АДГ в количестве большем, чем данная концентрация иодуксусной кислоты может не активировать. Повышенная продукция

АДГ должна обеспечивать этим мутантам более высокую скорость роста на этанол-содержащей среде и в отсутствии ингибитора. Выделенные с помогцью предлагаемой среды быстро растущие мутанты этанол-усваивающих дрожжей

Candida reguinyi 316 производят значительно больше алкогольдегидрогеназы, чем исходная культ ура.

В табл. 1 представлены величины удельной скорости роста (м) и активности алкогольдегидрогеназы. агара, стерилизуют в автоклаве при 120 С в течение 20 мин, охлаждают до 50 — 70 C и добавляют в стерильных условиях 0,7—

1,5 — вес.% 96%-ного этилового спирта.

Пример l. Селекция микроорганизмов. В качестве селектируемого материала используют суспензию клеток дрожжей Candida гвяо1пу 316, выращенную культивированием в течение 16 ч при 28-30 С на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: этанол 15, КйрРО 3, Na НРО4 ° 12-Í 0,6, MgS04 7НрО 1,3, мочевнна 1,9, водопроводная

Та блица 2

Процент клонов, обладающих данной величиной и

Величины удельной скорости роста (p ), ч

Среди отобранных на предлагаемой питательной среде

Среди отобранных на питательной известной среде

Candida Acinetobacter

reguinyi calcoacet 34

316

Candida

Acinetobacier

calcoacet 34

reguinyi

316

0,15 — 0,20

16,7

0,20 — 0,25

0,25 — 0,30

0,30 — 0,35

18,7

36,6

14,0

26;0

20,0

56,3

15,4

0,35 — 0,40

25,0

30,8

36,0

0,40 — 0,45

16,0

19,2

15,4

0,45 — 0,50

0,50 — 0,55

0,55 — 0,60

8,0

1 1,5

7,7

5 739103 вода — до 1 л. Для увеличения генетического

У разнообразия суспензия клеток может быть обработана мутагенами. Затем неразведенную суспензию высевают по 0,1 мл на чашки Петри с предлагаемой питательной средой следующего состава, вес.%:

Этиловый спирт 1,5

КН РО„ 0,25

Na> HPO 12Н, О 0,5

MgSOq 7Н2 О . 0,1 ю

Мочевина 0,19

Иодуксусная кислота 0,8

Агар 1,5

Вода Остальное

Через четверо суток культивирования при

30 С вырастают колонии устойчивых к иодуксусной кислоте мутантов. Частота их спонтанного возникновения у дрожжей Candida геди—

inyi 316 составляет 3, 7 ° 10 б, а после предварительной обработки мутагеном (00025М фанетил-ди-2-хлорэтиламином) — 1,25 ° 10 . Колонии отсевают, очищают рассевом разведенных суспензий на предлагаемой среде. Высгвая полученные мутанты в колбы с жидкой питательной средой указанного состава и измеряя конВ результате испытания значительно большего числа клонов исходной дрожжевой культуры, 6 центрацию биомассы каждого мутанта в процессе культивирования при 30 С, вычисляют удельные скорости роста (p ). Достаточно испытания 10 — 15 мутантов, выделенных на предлагаемой среде, чтобы найти несколько штаммов, превосходящих исходную культуру по удельной скорости роста.

Пример 2. Селекция микроорганизмов. Густую суспензию клеток бактерий Ас11netobacter calcoaceticus 34, подготовленную по примеру 1, высевают на чашки с предлагаемой питательной средой, имеющей следующий состав, вес.%:

Этиловый спирт 0,7

КН2 РО 0,3

NaqНРО4 12Н О . 0,6

MgSO4 ° 7Н2 О 0,13

Мочевина 0,34

Иодуксусная кислота 0,1

Агар 2,0

Вода Остальное

Дальше все по примеру 1.

В табл. 2 представлены данные по распределению величин р среди клонов, отобранных на сравниваемых питательных средах. выделенных на известной среде (их исследовано 60), не выявлено ни одного клона с вели739103

0,.5-0,6

0,1 — 0,13

0,19 — 0,34

0,1 — 0,8

1,5-2,0

Остальное

Составитель .Привалов

Редактор П. Кравцова Техред И.Асталош

Корректор Г.Назарова

Заказ 3008/5 Тираж 522

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент" г. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 чиной Ее; более 0,35 ч . В ro же время из всех 16 мутантов, выделенных на предлагаемой среде, обнаружено 4 клона (25%), у которых Ее выше -0,35 ч . Из 50 клонов бактерий, выделенных на известной среде нет ни одного с величиной д, превышающей 0,50 ч .

Среди 26 клонов тех же бактерий, выделенных на предлагаемой среде, 5 клонов (около 20%) имеют удельные скорости роста выше 0,50 ч, в том числе 2 клона, превосходящие исходную культуру по скорости роста на 77%. При селекции на предлагаемой среде смешаются величины е отобранных клонов в большуке сторону, Если для выделенных на известной среде клонов дрожжевой культуры величины д лежат в пределах 0,15 — 0,35 ч, то у отобранных на предлагаемой питательной среде клонов — в пределах 0,25-0,40 ч . Среди клонов дрожжей, выделенных на предлагаемой питательной среде, lie обнаружено таких„которые имели щ бь: удельную скорость роста ниже 0,25 ч, хотя в исходной культуре дрожжей такие клоны составляют почти половину популяции. Аналогичная картина наблюдается и при селекции бактерий. 25

Таким образом, у этанол-усваивающих микроорганизмов с помощью предлагаемой питательной среды возможно селективлое выделение мутантов, обладанлцих повышенной скоростью роста в результате увеличения продук- Зп ции алкогольдегидрогеназы. Эти мут<цсты способны на предлагаемой питательной среде образовывать видимые колонии (в отличие от огромцого оольшинства представителей исходной культуры), а при глубинном культивировании на жидкой питательной среде того же состава, но не содержащей ингпбитора АДГ (и агара), обладают более высокими удельными скоростями роста, чем исходная культура.

Предлагаемая питателыгая среда для селекции этанол-усваювающих микроорганизмов значительно (в десятки раз) ускоряет процесс селекции и обеспечивает возможность отбора наиболее быстро растущих, а, следовательно, наиболее продуктивных мутантных форм. формула изобретения

Питательная среда для селекции этанолусваивающих микроорганизмов, содержащая этанол в «ачестве источника углерода, калий фосфорнокислый однозамещенньтй, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, мочевину, агар и воду, о т л и ч а ющ а я с я тем,.что, с целью ускорения процесса селекций и возможности отбора наиболее быстро растущих мутантных форм микроорганизмов, ола дополнительно содержит иодуксусную кислоту в качестве ингибитора алкогольдегидрогеназы при следующем соотношении компонентов, вес.%:

Этанол 0,7-1,5

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,25 — 0,3

Натрий фосфорнокислый двузамещенный

Магний ссрнокислый

Мочевина

Иодуксусная кислота

Агар

Вода

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Коваленко С. П. и др. Выделение из природных источников микроорганизмов хорошо растущих на некоторых S2 — соединениях. "Микробы и их метаболиты", Минск, 1074, с, 126--130.