Способ стабилизации ферментных препаратов

Способ стабилизации ферментных препаратов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ТЕЛЬСТВУ

< 1740825 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 01.06.78 (21) 26.41299/28-13 с присоединением заявки )йо (23) Приоритет—

Опублмковано 1106.80. Бюллетень М 22

Дата опубликования описания 1 06-80 (51)М. Кл 2

С 12 D 13/10

Государственный комитет

СССР но делам изобретений н открытий (53) УДК 577.15.07 (088. 8) Е.Д. Ермолаев, Г.Г,Колтушкина, A.A.Лагздыня и Ю.П,Вейнберг (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к биохимической технологии, а именно, к способам стабилизации препаратов, применяемых в медицине, научных исследованиях и в пищевой промышленности.

Известны стабилизирующие агенты различного типа: буферные смеси, соли, глицерин,сывороточный альбумин, кислородсвязывающие агенты,диамины, гормоны,нуклеиновые кислоты,хелатные 19 агенты, образующие комплексы с тяже- . лыми металлами, тиолы и др. (1).

Наиболее близким по своей технической сущности к изобретению является способ стабилизации ферментных препаратов, предусматривающий использование и -меркаптоэтанола (2).

Однако стабилизирующий эффект . -меркаптозтанола для ряда ферментов значителен только при совместном 20 действии с комплекс ообраз ователями (например, ЭДТА) .

Кроме того -меркаптоз танол вещество токсичное, с резким запахом, отрицательно действует на нервную 25 систему, загрязняет окружающую среду.

Целью изобретения является повышение активности ферментов и предотвращение заражения окружающей среды токсичными веществамИ.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве соединения, связывающего ннгибирующие ферменты вещества, используют 8-меркаптохинолин в количестве 25-125 мкм/г фермента.

8-Меркаптохинолин(тиоксин)

С НтNS имеет структурную формулу

8-Меркаптохинолин — тиолсодержащее соединение, обладает хелатными свойствами и стабилизирует ферменты по двойному механизму за счет защиты SH-групп активных центров фермен.та от окисления и связыванием ионов тяжелых металов — ингибиторов, что позволяет выделять ферментные препараты с наименьшими потерями, предотвращая загрязнение окружающей среды токсичными веществами.

Пример 1. 100 г обезжиренной соевой муки экстрагируют 400 мл смеси 0,05 М ТРИС-буфера в 36%-ном этиловом спирте (рН-7,2), в которую предварительно добавляют 4 мл 2 5 °

2 т

10 М раствора 8-меркаптохинолина в этиловом спирте. Время экстракции

740825!

59

ll 5

950 б,б

1100

11,5

6,8

1700

11,5

2,26

4,1

5,5

7,0

5,5

4,0 составляет 1 ч при температуре 20ОС.

Полученную суспензию фильтруют, к

320 мл фильтрата добавляют 640 мл охлажденного до 4 С этилового спирта, в который предварительно вносят 6,4 мп

2,5 ° 10 М спиртового раствора 8-мер-, каптохинолина. Через 3 ч надосадочную жидкость декантируют. Полученный осадок растворяют в 1%-ном растворе цитрата натрия до конечного объема 200 мл и фильтруют.

Иэ полученного фильтрата уреазу охлаждают 600 мл охлажденного до 4 С этилового спирта, в который предварительно добавляют 6 мл 2,5 ° 10 М раствора 8-меркаптохинолина в этиловом спирте. Осадок промывают холодным ацетоном, затем высушивают. Получают. 6,5 г уреазы с удельной активностью 1700 ед. Самнера на 1 r белка.

При хранении препарата в течение года при комнатной температуре потери активности не превышают 5Ъ от исходной.

П риме р 2. 100 г сухих дрож— жей Saccharomyces trellis экстрагируют 1 л ° 10 М фосфатного буфера рН вЂ” 6,9, в который предварительно добавляют 20 мл 2,5 е 1ФМ 8-меркаптохинолина в этиловом спирте. Время экстракции 8 ч при температуре 20 С.

Суспензию центрифугируют, полученный осветленный раствор концентрируют в 5 раз с использованием ацетахцеллюлозной мембраны УАМ 300, концентрат проьывают диафильтрацией двойным объемом 10 М фосфатного буфера, содержащего 0,5% MgCI . К .200 мл концентрата добавляют 200 мл глицерина, в который предварительно добавляют

"2

4 мп 2, 5 10 М раствора 8 меркаптохинолина в этиловом спирте.

Удельная активность полученного ферментного препарата составляет

7 ед/мг белка, концентрация белка -10 Мг/мл.

Уреаз а бе з с табилиз ирующего агента

o -g -2

Уреаза 2 10 М МКЭ + 2 10 N

ЭДТА

-4

Уреаза 2„5 ° 10 М МКХ (25 мкМ

8-МКХ на 1 г уреазы}

)8-Галактозидаза . 5.10 М МКЭ

-Галактозидаза 5 10 М

-МКХ (125 мкМ на 1 r фермента) После хранения ферчентного препарата в течение 5,5 мес. при 40 С потери активности не превышают 13% от исходной.

В таблице представлены результаты сопоставления стабилизирующего эффекта 8-меркаптохинолина (8-МКХ) и меркаптоэтанола (МКЭ) с ЭДТА.

Из таблицы следует, что для стабилизации уреазы требуется в 100 раз меньшая (мол ярная ) концентрация 8: меркаптохинолина по сравнению со смесью меркаптоэтанола и ЭЦТА, причем потеря в активности фермента эа один и тот же срок хранения при комнатной температуре снижается с 27 до 43.

При стабилизации Р -галактозидазы предлагаемым агентом требуется в

10 раз меньшая (молярная) концентрация, чем -меркаптоэтанола, причем удельная активность фермента при очистке с предлагаемым стабилизатором возрастает в 1,6-2 раза, а потери активности при хранении фермента снижаются с 25 (стабилизатор меркаптоэтанол) до 133.

Предлагаемый стабилизатор как нелетучее и нетоксичное соединение обеспечивает охрану окружающей среды при стабилизации ферментов, исключая применение токсичного,с резким запахом, действующего на центральную нервную систему, Технико-экономический эффект предлагаемого технического решения заключается в обеспечении стабилизации ферментов, в частности, уреазы и

-галактоэидазы в технологическом процессе выделения и очистки, а также в процессе их хранения.

Экономический эффект составит

170 тыс.руб. в год.

7408"5

Формула изобретения

Составитель Н.Паников

Техред И.Петко Корректор В.Бутяга

Редактор Н. Потапова

Тираж 522 Подписное цНИИПИ Государствениого комитета СССР по целам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 3154/31

Филиал ППП Патент, г. ужгород, ул. Проектная, 4

Способ стабилизации ферментных препаратов, предусматривающий введение соединений, связывающих ингибирующие ферменты вещества, о т д и ч а ю - шийся тем, что, с целью повнщения активности ферментов и предотвращения заражения окружающей среды токсичными веществами, в качестве соединения, связывающего ингибирующие ферменты вещества, используют .

8-меркаптохинолин в количестве 251 25 мк M/ã фермен та.

Источники информации, приняты е во внимание при экспертизе

1.Wiseman D.À.IndustriaI Enzyme

StabiIisation. — J. Process Biochemestry, рр.14т15, 1973 °

2. Wong В.Ь., Shore С.R. SingIestep purification of urease by айfinity chromatography. — Canadian

Q.MicrobioIogy, v.20, рр.624 629, 1974.