Способ получения противостолбнячной преципитирующей сыворотки

Способ получения противостолбнячной преципитирующей сыворотки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советски к

Социалистических

Реслублик (»>741883

-Ф (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 25.05.76 (21) 2364972/28-13 с присоединением заявки ¹ —— (23) Приоритст-(51) . Кл з

А 61 К 39/08

Гввударстввииый комитет

Опубликовано 25.06.80. Бюллетень № 23

Дата опубликования описания 05.07.80 (53) УДК 615.373..34 (088.8) ав делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

В. К. Голшмид и Д. A. Закгейм

Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОСТОЛБНЯЧНОй

ПРЕЦИ(1ИТИРУЮЩЕИ СЫВОРОТКИ

1Î

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения противостолбнячной сыворотки, применяемой в медицине.

Известен способ получения противостолбнячной преципитирующей сыворотки путем иммунитации животных — продуцентов возрастающими дозами инактивированной культурой возбудителя столбняка с последующим забором крови и отделением сыворотки II).

Однако сыворотка, полученная таким способом, не обладает высокой специфичностью, так как в ней содержатся антитела и к токсическим и соматическим белкам.

Целью изобретения является повышение специфичности сыворотки.

Эта цель достигается тем, что исходную культуру многократно обрабатывают смесью

0,9%-го раствора хлористого натрия и

0,4%-го раствора формалина, после инактивации культуру гомогенизируют и полученный гомогенат трахкратно вводят продуценту внутривенно с интервалом в 4 дня и целевой продукт очищают с помощью ионитов.

Кроме того, целевой продукт очищают сорбцией на ДЭАЭ-сефадексе А-50 или геле

ДЭАЭ-ЭД-5 из 0,005 М фосфатного буфера рН 6,0-6,5 и элюируют тем же раствором с

0,4 М хлористого натрия.

Способ поясняется следующим примером.

Пример. Получение сыворотки осуществляют в несколько этапов.

Первый этап получение антигена для иммунизации.

Столбнячные микробы штамма 471 (Копенгаген) засевают на казеиново-растительную кислотно-гидролизатную питательную среду. Культивирование проводят 2-4 дня, чтобы получить максимальное количество микробных тел при минимальном содержании токсина при +34 С. Выемки культуры вносят в центрифужные стаканчики и центрифугируют при 3000-5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают ъ 20%-ную едкую щелочь. Осадок 3-5 раз отмывают физиологическим раствором с 0,4% формалина.

Отмытый осадок заливают физиологическим раствором с 0,4% формалина, помещают на сутки в холодильник при +4 С для экстрагирования токсических белков, центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, 74iSS3

Фор пула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор П. Горькова Техред К. Шуфрии Корректор Н. Григорук

Заказ 3343/3 Тираж 573 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий ! 13035, Москва, Ж вЂ” -35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, осадок снова заливают физиологическим раствором. Такую обработку проводят до 5 раз.

После экстрагирования токсических белков культуру заливают 0,4о/о-ным водным раствором формальдегида и помещают в термостат на 20 дней при 37 С. Полученную ана-культуру четырехкратно отмывают попеременно дистиллированной водой и физиологическим раствором с центрифугированием при 3000-5000 об/мин. Отмытую анакультуру дезинтегрируют с бусами при 3000 колебаний в минуту; на втором этапе иммунизируют кроликов.

Дезинтегрированные микробные тела разводят физиологическим раствором с мертиолятом в концентрации 1:10000 до мутности, соответствующей стандарту мутности l млрд микробных тел коли. Иммунизацию проводят с неполным адъювантом Фрейнда. Лдъювант вводят в две точки по 0,5 мл подкожно вместе с антигеном (0,5 мл). Одновременно 0,5 мл антигена вводят внутривенно. Вторая инъекция 1 мл и третья 2 мл внутривенно. Интервалы между инъекциями 4 дня.

Кровопускание проводят на 6-ой день после последней дозы.

На третьем этапе осуществляют очистку сыворотки.. Для этого нативные кроличьи сыворотки смешивают с ДЭАЭ-сефадексом

А — 50 или ДЭАЭ вЂ” ЭД вЂ” 5 уравновешенным 0,005 М фосфатным буферным раствором рН 6,0 в соотношении 5 г геля на 10 мл сыворотки, экспозиция 30 мин при комнатной температуре. Взвесь фильтруют через маркизет. К фильтрату прибавляют новую порцию ионообменного геля в количестве

3 r на 10 мл фильтрата (экспозиция 20 мин, фильтру1от через маркизет). Оба осадка переносят в стеклянные емкости и смешивают с 0,005 м фосфатным буферным раствором рН 7,0 в количестве, в 5 раз превышающем объем исходной сыворотки. Взвесь фильтруют через маркизет и дополнительно дважды промывают таким же объемом фосфатного буфера. Промытый осадок переносят в колонки. Десорбцию антимикробных антител проводят 0,005 М фосфатным буферным раствором рН 7,0 с хлористым натрием в концентрации 0,4 моля. Пробы собирают объемом по 5-7 мл. Окрашенные пробы объединяют и в них вносят консервант (например, мертиолят в концентрации 1:10000) .

Полученная сыворотка при иммунопроцепитации в агаре со столбнячными анатоксинами вызывает образование линий преципитации, которые пересекались с линией, образованной монозональной антитоксической противостолбнячной сывороткой.

Предлагаемый способ обеспечивает получение высокоспецифической сыворотки, освобожденной от антитоксического компонента.

1. Способ получения противостолбнячной

R0 преципитирующей сыворотки путем иммунизации животных-продуцентов возрастающими дозами инактивированной культурой возбудителя столбняка с последующим забором крови и отделением сыворотки, отличающий2$ ся тем, что, с целью повышения специфичности сыворотки, исходную культуру многократно обрабатывают смесью 0,9 /о-го раствора хлористого натрия и 0,4 /о-го раствора формалина, после инактивации культуру гомогенизируют и полученный гомогенат трехзц кратно вводят продуценту внутривенно с интервалом в 4 дня и целевой продукт очищают с помощью ионитов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевой продукт очищают сорбцией на

ДЭАЭ-сефадексе А-50 или гале ДЭЛЭ-ЭД-5 из 0,005 М фосфатного буфера рН 6,0-6,5 и элюируют тем же раствором с 0,4 М хлористого натрия.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Руководство по сывороточному и вакцинному делу, М., 1943, с. 262 †2.