Способ подготовки колоний бактерий для электронной микроскопии

Способ подготовки колоний бактерий для электронной микроскопии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

«i>742461 (61) Дополнительное к. авт. свид-ву—,,(„г

С 12 К 1/00 (22) Заявлено 19.1278 (21) 27006 71/30-15 с присоединением заявки М— (23) Приоритет—

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДН 576, 8 . 093 (088. 8) Опубликовано, 250680. Бюллетень НВ 23

Дата опубликования описания 30. 06 . 80 (72) Авторы изобретения

Е. А. Асташова и В. C . .Гуткин (71) Заявитель

Всесоюзный ордена Ленина институт экспериментальной ветеринарии (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КОЛОНИЙ БАКТЕРИЙ ДЛЯ

ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в процессе проведения микробиологических, цитологических, цитохимических, иммунобиологических и других исследований.

Известны способы подготовки колоний бактерий для изучения их структурной организации с помощью электронно-)p го микроскопа. заключающиеся в нанесении на поверхность arapa пленки коколлодия на амилацетате, посеве бактерий на эту пленку, инкубировании их в термостате, разрезании пластинки агара с пленкой и колониями бактерий на кусочки 8-10 мм, погружении в дистиллированную воду, осторожном удалении агара под углом 45о, подведении сеточки под пленку с бактериями и высушивании ее; в созывах колоний бактерий с агара раствором фиксатора (для максимального сохранения поверхностных структур), немедленном центрифугировании, постфикации осадка, заключении объектов в расплавленный агар, нарезании мелких кусочков застывшего arapa с биологическим материалом с последующим общепринятым заключением в эпоксидные смолы (1),(2) . gp

Недостатками таких способов являются многоэтапность и использование физических факторов, вызывающих ряд артефактов, в результате чего происходят потери микроорганизмов в процессе фиксации и я следующей обработки материала, нарушение пространственных взаимосвязей бактерий в колонии, нарушение ориентации самих колоний в сравнении с первоначальной, артефакты в структурной организации бактерий.

Известен также способ вырезания кусочков arapa с колониями и последующей их фиксацией. Для этого выращивают бактерии на плотной питательной среде, вырезают кусочки агара с колониями и переносят их в раствор фиксатора с последующей обработкой для электронной микроскопии (3).

Недостатками такого способа являются потеря биологического материала и нарушение исходной орИентации колоний. Ориентация нарушается во время переноса кусочков агара с колони ями в фиксирующий раствор. Кроме того, агар во время полимеризации эпоксидных смол (при температуре более ,высокой, чем точка плавления агара) смешивается с этими смолами, что мо742461

Формула изобретения

Составитель М. Белоусова

Редактор М. Рогова Техред И.Асталош Корректор Н. Стец

Заказ 3407/27 Тираж 522 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 жет служить одной из причин артефактов ультраструктуры бактерий.

Цель изобретения — исключение потери микроорганизмов в процессе подготовки препаратов и сохранение их исходной ориентации в колониях.

Это достигается тем, что перед помещением бактерий на покрывные стекла последние предварительно покрывают слоем яичного белка. Способ дает воэможность сохранить пространственную ориентацию и структуру колоний, предотвращая их потери при последующей обработке, исключает действие травмирующих факторов (ускорение, высокая температура, расплавление агара при полимеризации и др.), вызывающих различные артефакты.

Способ осуществляется следующим образом.

На чистые покрывные стекла наносят максимально тонкий (не более

0,2 мм) слой яичного белка и дают ему подсохнуть при комнатной температуре в течение 2 — 3 мин. После этого белковой поверхностью стекла прикасаются к колониям, выросшим на агаре. При этом колонии бактерий легко прилипают к белковому слою. Сразу после этого покрывное стекло с колониями опускают в раствор фиксатора (колониями вверх) . Дальнейшая проводка осуществляется по стандартной методике. При этом, благодаря наличию белкового слоя на покрывном стекле, колонии микроорганизмов не открепляются. Далее покрывное стекло со стороны погружают в эпоксидную смолу (плоская заливка) . После полимеризации эпоксидной смолы с погруженными в нее колониями бактерий покрывное стекло также, благодаря наличию белкового слоя легко снимается с помоl щью жидкого азота (для чего погружают стекло в жидкий азот на 3-5 сек) .

Предлагаемый способ испытывался в течение 4-х лет в лаборатории биофизики. Результаты испытаний сравнивались с результатами, полученными при снятии колоний на покровные стекла без предварительного нанесения белкового слоя, и с результатами способа, принятого за прототип. Время проводки материала до заключения в эпоксидные смолы варьировало от 6 до 96 час без потери колоний, что позволяет использовать .предлагаемый способ для подготовки к электронно-микроскопическому исследованию колоний бактерий: разных видов, отличающихся проницаемостью клеточных стенок и требующих разной по длительности обработки для электронной микроскопии.

Предлагаемый способ обеспечивает

15 сохранение ориентации колоний, соответствующей их росту на плотной питательной среде, и позволяет íà серийных параллельных срезах изучать как ультраструктуру, так и простран20 сгвенные взаимосвязи бактерий на разной глубине бактериальных колоний.

С п ос об подго тов к и кол он ий ба к те— рий для электронной микроскопии, включающий помещение бактерий на покрывное стекло и их фиксацию, отличающийся тем, что, с целью исключения потери микроорганизмов в процессе подготовки препаратов и сохранения их исходной ориентации в колониях, перед помещением бактерий на покрытые стекла последние предварительно покрывают слоем яичного белка.

Источники информацли, принятые во внимание при экспертизе

40. 1. Н1И er J., Knaysi J., Baker R., Bact 3., 1948, т. 56, с. 569 — 576.

2. Высоцкий В. В. и др. ЖМЭИ, 1977, т. 8, с. 90-95.

3. Константинова Н. Д. и др. ЖМЭИ.

1977, т. 4, Р с. 50-53.