Способ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде

Способ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

! г - 4,Ы» пat,; с<

0-и H -Ай и.EI

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскнк

Соцналнстнчесннв

Республнк

< 1745941

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт, свид-ву —

{я)м. к. (22) Заявлено 1206.78 (21) 2629673/28-13 с присоединением заявки ¹ 2625749/13

С 12 К 1/00

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (23) Приоритет—

Опубликовано 07.07,80. Бюллетень ¹ 25

{53) УДК;576. 8 ° 093,,1(088.8) Дата опубликования описания 070780 (72) Авторы изобретения

Н, A. Хозова и Ю. Г. Сучков ростовский-на-дону государственный научноисследовательский противочумный институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТИ В ЖИДКОЙ

ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

Изобретение относится к медицине, а именно микробиологии.

Известен способ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде путем внесения в нее тест-культуры с последующим инкубированием и определением количества никотиновой кислоты по мутности среды (1) .

Однако известный способ обладает недостаточно высокой точностью.

Целью изобретения является ïîâûшение точности способа.

Эта цель достигается тем, что в качестве тест-культуры используют штамм Gersinia pestis 1300 Nic или штамм Gersinia pestis EV 28/8 Nic.

Никотинадмидзависимый мутант

G.pestis 1300-215 Nic получен иэ вирулентного штамма 1300 после воздействия нитроэометилмочевиной из числа вариантов, устойчивых к налидиксовой кислоте.

Мутант 1300-215 Nic обладает ста25 бильно высокой избирательной реакцией на никотиновую кислоту.

Штамм Gersinia pestis 1300-215 Nic .депонирован в коллекции Всесоюзного ордена Трудового Красного, Знамени научно-исследовательского противочумного института "Микроб".

Штамм Gersinia pestic 1300-215 Nlc характеризуется следующими культураль но-морфологическими и фиэиологобиохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Полиморфные грамотрицательные палочки с закругленными концами размером 1-2 мкм в длину и 0,3-0,5 мкм в ширину. Жгутиков не имеет, спор не образует. Бульон Хоттингера.

Хлопьевидный осадок, бульон прозрач" ный. Arap XoTTHHrepa. Образует колонии сероватого цвета диаметром

0,5-2 мм с приподнятым зернистым центром и фестончатой периферической зоной. ,Физиолого-биохимические признаки.

Оптимум роста 26-28 С °

Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, галактоэу, маннозу.

Восстанавливает нитриты в нитраты.

Желатину не разжижает.

Индол не образует.

745941

° 5

Сероводород выделяет.

Продуцирует пестицин 1.

Среда Джексона-Берроуза с гемином.

Образует непигментированные колонйи.

Требует для роста наличия в питательной среде лейцина, метионина, фенилаланина, трес нина, цистеина и никотиновой кислоты или никотинамида.

Вирулентные свойства.

Авирулентен для белых мышей при подкожном введении от 10 до 10Е микробных клеток и для морских свинок до 10 микробных клеток.

Никотинамидэависимый мутант

G. pestis EV 28/8 ИЗ.с получен из вакцинного штамма EV после воздействия нитрозометилмочевиной иэ числа вариантов, устойчивых к налидиксовой кйслоте.

Мутант 28/8 Niс обладает стабильно высокой избирательной реакцией на никотиновую кислоту. 20

Штамм gers inia pesti s 28/8 й! с депонирован в коллекции Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института

"Микроб". 25

Штамм Gers in ià pest i s 28/8 Ni ñ характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологобиохимическими признаками. Культурально-морфологические признаки.

Полиморфные грамотрицательные палочки с закругленными концами размером 1-2 мкм в длину и 0,3-0,5 мкм в ширину. Жгутиков не имеет, спор не образует.

Бульон Хоттингера. Хлопьевидный осадок, бульон прозрачный. Агар Хоттингера. Образует колонии сероватого цвета диаметром 0,5-2 мм с приподнятым зернистым центром и фестонча- 40 той периферической зоной.

Физиолого-биохимические признаки.

Оптимум роста 2б-28 С.

Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, 45 маннит, арабинозу, галактоэу, маннозу.

Восстанавливает нитриты в нитраты.

Желатину не разжижает. 50

Индол не образует.

Сероводород выделяет.

Продуцирует пестицин 1.

Среда Джексона-Берроуза с гемином.

Образует непигментированные колонны.

Требует для роста наличия в питательной среде лейцина; метионина, фенилаланина, треонина, цистеина и никотиновой кислоты или никотинамкда.

Вирулентные свойства.

Авирулентен для белых мышей при Щ подкожном введении от 10 до 108 микробных клеток и для морских сви-, нок до 10 о микробных клеток.

Пример. В качестве основной среды используется синтетическая среЦа на фосфатном буфере М/15 рН

7,2. Непосредственно перед опытом вносят стерильно в 100 мл основы следующие компоненты: 0,5 мл 20%-ного раствора (МН4 ) д S 04, О, 25 мл 10%-ного

МАМБО 7kzO, 0,5 мл 40%-ной глюкозы, раствор сульфита натрия до концен трации 0,1% и аминокислоты (лейцин, метионин, треонин, фенилаФанин и цистеин) и дозах 0,01 мг/мл. Готовят два параллельных ряда пробирок с последовательными десятикратными разведениями исследуемой питательной среды. Разводят до 10 основной синтетической средой без добавления никотиновой кислоты.

Для построения стандартной кривой роста тест-штамма также два параллельных ряда пробирок заполняют по 4,5 мл основной синтетической среды с добавлением никотиновой кислоты, и количествах 10 10 1 10

-з

1 I 1

10, 10, 10 мкг/мл. Затем в каждую пробирку как в опытном, так и в стандартных рядах, вносят по 0,5 мл истощенной суспенэии тест-штамма, создавая посевную концентрацию

200 млн. мк./мл. Посевы помещают в термостат при 28 С.

После выдерживания посевов в течение суток производят ежедневное определение интенсивности роста тест-штамма путем измерения мутности среды с помощью нефелометра. По достижении максимальных показаний прибора и появлении тенденции к снижению опыт прекращают.

С целью снятия показаний нефелометра непосредственно с пробирок, выпиливают специальные черные эбонитовые вкладыши с окнами для светового пучка, которые позволяют в течение длительного времени наблюдать посевы в жидких средах,не нарушая их стерильности.

Стандартную кривую вычерчивают на основе средних показаний из двух определений мутности в нефелометре для каждой точки стандартного раствора витамина. На оси абсцисс откладывают десятйчные логарифмы кднцентраций витамина, на оси ординат наносят средние значения показаний прибора. Соединяя точки пересечения, получают стандартную кривую, характеризующую ответную реакцию тесткультуры в зависимости от концентрации никотиновой кислоты в среде.

Пользуясь ею путем экстраполирования определяют содержание витамина в миллилитре испытуемого раствора для каждой точки.

Использование изобретения позволяет определить никотиновую кислоту в пределах до 10 мкг/мл, что на порядок превосходит чувствительность известного способа.

745941

Составитель Е. Дубовицкая

Редактор С. Тараненко Техред1 М. Петко Корректор Е Папп

Тираж 522 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 407б/10

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород,,ул. Проектная,4

Формула изобретения

Способ количественного определения никотиновой кислоты в жидкой питательной среде путем внесения в нее тест-культуры с последующим ин-. кубированием и определением количества никотиновой кислоты по мутности среды, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве тест-культуры используют штамм Gers! п1a pest i c

1300-215 Nic или Gers in I a pest i s EV

28/8 N i c.

Источники инФормации, 5 принятые во внимание при экспертизе

1. Одинцова E.È. Микробиологические методы определения витаминов. . М., 1959, с. 184-195.