Способ получения носителя для иммобилизации биологически активных веществ

Способ получения носителя для иммобилизации биологически активных веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

) 4 r с. о 3с ф,у.еаза, э,п-; ..и -Фк f.» -° " """ " с-rОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистическик

Республик («)749847

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к ввт. свид-ву

Р1)М. К .з (22) Заявлено 011177 (21) 2558255/23-04 с присоединением заявки №

С 07 G 7/02

С 07 Ф 7/02, Государственный комитет

СССР о делам изобретений н открытий (23) Приоритет

Опубликовано 230780.Бюллетень ¹ 27 (53) УДК 577.15.07 (088. 8) Дата опубликования описания 230780

A. К.Арен, Д.Я.Дайя, A.È. Кестнер, Х. я. Киппер, К.A „Кивисилла, A.Ý.Ýðèí, Х.Р.-В. Егоров, A.,ß.Oçîëèíûà и К.Э.Паппель (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной биохимии и Таллинский политехнический институт (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Изобретение относится к химической и микробиологической промышленности и может быть использовано для получения активированных носителей для 5 иммобилизации биологически активных веществ, в частности ферментов. Полученные на их основе иммобилизованные биологически активные вещества могут быть применены как лекарственные препараты; биохимические реактивы и как новый тип промышленных катализаторов — биокаталиэаторы.

Иммобилиэация ферментов путем их присоединения к нерастворимым носителям является хорошо известным спо15 собом улучшения технологических показателей этих биокатализаторов, Из большого числа материалов са- 2О мыми распространенными носителями являются неорганические кремнесодержащие пористые вещества: преимущественно пористое стекло, силохром, силикагель и керамические материалы. 25

Указанные носители часто покрывают полимерной пленкой, содержащей реакционноспособпые группы, с последующей активацией носителя бифункциональным реагентом, ковалентно евя- 3g зывающим иммобилиэуемый фермент с носителем.

Носители такого типа характеризуются хорошими гидродинамическими свойствами и стабильностью вследствие упрочения структуры носителя..Известен способ получения носителя для иммобилизации биологически активных веществ путем обработки кремнеземного носителя раствором полимера (поликарбамида, полиметакрилата, найлона) .

Активацию покрытого полимерной пленкой носителей проводили кипячением с гидразингидратом с последующим переводом в диизоцианаты через амиды кислот (1) . Однано полученные таким образом носители не обеспечи- вают стабильности, достаточной для применения полученных на их основе иммобилизованных ферментов в промышленных процессах.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения носителя для иммобилизации белков путем обработки пористого неорганического материала органическим пленкообраэующим веществом с последующей активацией носителя глутаравым ди749847 альдегидом, диизоцианатом или п-бензохиноном 2/. По данному способу неорганический пористый материал (силохром, силикагель) обрабатывают смесью адипиновой кислоты и 1,6-гексаметилендиамина в соотношении эквивалентов соответственно 1:1,5 и осуществляют поликонденсацию полимера при 180-200 С в атмосфере инертного о газа.

Затем носитель промывают водой и ацетоном и сушат при 120 С. Получают носитель с содержанием активных аминогрупп в количестве 50 мкв/г носителя.

Недостатками укаэанного способа является сравнительно невысокая реакционноспособность и недостаточная высокая стабильность в процессе использования получаемого носителя, обусловлейная природой ПолиМера.

Целью изобретения является улучшение качества носителя, т.е. повышение реакционноспособности носителя и стабильности в процессе использования.

Указанная цель достигается тем, что в качестве пленкообразующего вещества применяют диизоцианат адипиновой кислоты, а обработку неорганического материала осуществляют последовательно диизоцианатом адипиновой кислоты при 105-115 С и 1,б-гексао метилендиамином при температуре кипения реакционной смеси при молярном соотношении эквивалентов диизоцианат:

1,б-гексаметилендиамин 1:(1,5-2) с высушиванием после каждой обработки при 100-120 С в течение 1,5-2 ч.

Согласно. изобретению описывается способ получения носителя для иммобилизации биологически активных веществ

/ в частности, ферментов, путем обработки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, представляющим собой б-членное циклическое насыщенное соединение, и 1,б-гексаметилендиамином с последующей активацией носителя реагентом, выбранным из группы, включающей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой или винной кислоты, с высокой реакционноспоообностью и стабильностью в процессе использования, заключающийся в том, что неорганический материал обрабатывают последовательно диизоцианатом .адициновой кислоты при 105-115ОC и

1,б-гексаметилендиамином при температуре кипения реакционной смеси при молярном соотношении эквивалентов диизоцианатг 1,б-гексаметилендиамин

1:(1,5-2), с высушиванием после каждой обработки при 100-120ОС в течение 1,5-2 ч.

Предпочтительно процесс проводят следующим образом.

С целью увеличения количества реакционнопособных гидроксильных групп на поверхности неорганических пористых материалов (кремнеземов) последние обрабатывают растворами йаОН

HCl и вы высушивают до постоянного веса.

Затем носитель обрабатывают раст5 вором диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле при нагревании до 110Й

12п С в течение 1,5-2 ч с последуккчим высушиванием при 100-120ОС и водным раствором 1,6-гексаметилендиамина при g кипячении в течение 15 мин с последующим высушиванием при 120 С.

В результате обработки получают носитель с содержанием активных аминогрупп в количестве 100 мк экв/г 5 носителя, который далее активируют глутаровым диальдегидом или диизоцианатом адиппиновой или винной кислоты. Полученный носитель пригоден для иммобилизации биологических активных веществ, например, ферментов.

Синтезированная на поверхности неорганического пористого материала поликарбамидная пленка по своей природе обладает улучшенными свойствами — повышенной стойкостью к дейст25 вию воды и минеральных кислот, к действию различных атмосферных воздействий. При нагревании между молекулами поликарбамида образуются дополнительные поперечные связи, что

gg способствует образованию равномерной полимерной пленки, а также укреплению связи полимера с поверхностью носителя.

Это обусловливает повышенную стабильность получаемого носителя в процессе его использования.

Пример 1. К 5 r силохрома или силикагеля добавляют 10 мл

0,1 н раствора едкого натрия. Пропитанный щелочью силохром высушивают при 130С С. После этого материал промывают 10 мл 0,15 н соляной кислоты и высушивают при 130 С.

Обработанный таким путем носитель

45 пропитывают 7 мл 0,25 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле. Смесь выдерживают при 110 С в течение 1,5 ч. После этого материал высушивают при 120 С. Затем носитель кипятят в 0,4 н водном растворе 1,б-гексаметилендиамина в течение 1 ч. Затем носитель фильтруют, промывают водой и ацетоном и высушивают при 120 С.

В результате такой обработки полУчают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 100 мк экв на 1 г носителя.

Пример 2. 5 r обработанного растворами едкого натрия и соляной

60 кислоты (пример 1) носителя пропитывают 7 мл 0,3 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле. Смесь выдерживают при 110ОC в течение

45 мин. После этого материал высуши65 вают при 120ОС. Затем носитель кипя749847 тят в 0 6 н водном растворе 1,6-гексаметилендиамина в течение 15 мин.

Затем носитель фильтруют, промывают водой и ацетоном и высушивают

-при 120ОС.

В результате такой обработки пО- 5 лучают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 10бмк, экв на 1 г носителя.

Носитель, полученный по примерам

1 и 2, используют для иммобилизации 10 ферментов с помощью бифункциональных реагентов, таких как глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой или винной кислоты.

Пример 3. Получение нераство-15 римого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного поликарбамидом, активированием глутаровым дкальдегидом.

К 5 r модифицированного поликарбамидом носителя (пример 1) добавляют 15 мл 2 -ного водного раствора глутарового диальдегида. Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 часов.

После этого материал отмывается дистиллированной водой от непрореагировавшего глутарового диальдегида на воронке Бюхнера до исчезновения глутарового диальдегида в промывной воде и к влажному носителю добавляют

5 mr раствора химотрипсина с концентрацией 50 мг/мл в боратном буфере рН 8,0. Смесь перемешивают, ва-. куумируют для удаления воздуха из пор и выдерживают при 20 С в течение 35

=--=1 ч. После инкубации препарат проьывают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0, 1 Y. раствором хлористого натрия и затем еще боратным буфером, добавляя эти растворы пор- 40 циями. Объем промывных вод составляет 100 мл. Полученный иммобилизованный .препарат хранят во влажном виде в боратном буфере в холодильнике.

ФерментативнуЮ активность препа- 4 рата определяют на синтетическом субстрате — этиловом эфире ацетилтирозина (АТЭЭ). Активность равняется

1550 Е/г (сохраняется 504 от исходной активности) содержание белка

17,4 мг/г. Стабильность препарата оценивают по остаточной активности после проведения промывки препарата

100 мл 2%-ным раствором казеина рН 8,0 в колонке с диаметром 6 мм и высотой столба препарата 70 мм в течение 24 ч. После промывки сохраняется 70% от исходной активности.

Пример 4. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифици- 60 рованного поликарбамидом, активированием диизоцианатом адипиновой кислоты.

К 5 г модифицированного поликарбамидом носителя (пример 1) добав- 65 ляют 20 мл 0,25 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле и смесь кипятят при 110"С в течение 1 ч. После этого носитель фильтруют, промывают ацетоном и высушивают при 110 С. Вследствие такой обработки получают носитель с активными изоцианатными группами (80 мк.экв/г).

Такой носитель смачивают 8 мл бо- . ратного буфера. Иммобилизацию фермента проводят как описано в примере 2.

При иммобилизации панкреатина получают препарат с активностью 1100 E/ã (на АТЭЭ) (сохраняется 42% от исходной активности) с содержанием белка

17,8 мг/г.

Для определения стабильности препарата проводят гидролиз 2% раствора казеина в реакторе перемешивания при

30 С в течение 17 ч. После такого гидролиза остаточная активность составляет 44% от исходной.

Пример 5. Получение нерастворимбго феряентного препарата с исползованием носителя, модифицированного поликарбамидом, активированием диизоцианатом адипиновой кислоты.

5 r модифицированного поликарбамидом носителя (пример 1) обрабатывают раствором диизоцианата адипиновой кислоты, как в примере 3. Активированный носитель содержит 100,0 мк экв активных изоцианатных групп íà r) смачивают 8 мл боратного буфера.

Иммобилизацию химотрипсина проводят, как описано в примере 2..Получают препарат с активностью АТЭЭ 1840 Е/r (сохраняется 49Ъ от исходной активности) с содержанием белка 18,2 мг/г.

После промывки препарата 2%-ным раствором казеина остаточная активность составляет 57% от исходной.

Пример 6. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного поликарбамидом, активированием диизоцианатом винной кислоты.

К 5 r модифицированного поликарбамидом носителя (пример 1) добавляют 20 мл 0;01 н. водного раствора диизоцианата винной кислоты, рН которого непосредственно перед использованием вакуумируют и контактируют в течение 1 часа. После этого носитель фильтруют и промывают боратным буфером. Иммобилизацию химитрипсина на влажном носителе проводят, как описано в примере 2. Получают препарат с активностью 1670 E/r (на ТАЭЭ) и содержанием белка

24,7 мг/г. Выход иммобилизации по активности составляет 44%. После промывки препарата 2% раствором казеина остаточная активность составляет

68% от исходной.

Пример 7,. Получение нерастворимого ферментного препарата с. 749847

Составитель О.Скородумов

Редактор П.Горькова . Техред И Асталош Корректор Г.Решетник

Заказ 4550/18 Тираж 495 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР .поделам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 использованием носителя, модифицированного поликарбамидом, активированием глутаровым диальдегидом.

10 мл раствора Р-галактозидазы в

0,2 М ацетатйом буфере с рН 4,2 контактируют с 0,24 мп 25%-ого раствора глутарового диальдегида при комнатной температуре в течение 16 минут.

После этого полученный раствор пропускают при помощи перистальтического насоса через 1 г модифицирован:.ого поликарбамидом носителя (пример

1), загруженного в термостатируемую колонку. Иммобилизацию проводят при

38 С в течение 2,5 ч. После этого остаточный раствор отделяют от носителя и препарат промывают 100 мл

-ацетатного буфера с рН 4,2, 50 мп

0,5 И раствора хлористого натрия и затем 100 мп ацетатного буфера.

Полученный иммобилизованный препарат f& -галактозидазы количественно вымыва1от иэ колонки, отжимают и определяют его активность по начальной скорости расщепления о-нитрофенил-р-1)-галактопиранозида. Актив= ность препарата составляет 187 E/г, содержание белка в препарате 40 мг/г и выход иммобилизации по активности

40%. Время полураспада активности препарата при гидролизе 5% раствора лактозы в. термостатируемой колонке при 60 С равняется 30 дням.

Формула изобретения

Способ получения носителя для иммобилизации биологически активных

1 веществ путем обработки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, представляющим собой 6-членное иклическое насыщенное соединение, и

1,6-гексаметилендиамином с последующей активацией носителя реагентом, выбранным иэ группы, включающей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой или винной кислоты, о т—

10 л и ч а ю шийся тем, что, с целью улучшения качества носителя, в качестве органического пленкообраэующего вещества используют диизоцианат адипиновой кислоты и обработку неорганического материала осуществляют последовательно диизоцианатом адипиновой кислоты при 105-115ОC и

1,6-гексаметилендиамином при температуре кипения реакционной смеси при молярном соотношении эквивален20. тов диизоцианат: 1,6-гексаметилендиамин 1:(1,5-2) с высушиванием после каждой обработки при 100-120 С в течение 1,5-2 часов.

Источники информации, 25 принятые во внимание при экспертизе

1. Киппер P.Õ., Эрин A.Ý., Егоров Х.Я., Кивисилла К.A., Кестнер A.È.

"Получение активированных носителей для иммобилизации ферментов", Труды

30 Таллинского политехнического института, 1976, Р 402, с. 21 28.

2. Авторское свидетельство СССР по заявке Р 2506847/04, кл. С 07G 7/02, С 07 F 7/02, З5 18.07.77 (прототип).