Способ выделения -триптофана

Способ выделения -триптофана

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСА ИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

<„>749889

Ф ь

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕДЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву

{51}/ . кл з (22) Заявлено 030277 (21) 2450067/28-13 с присоединением заявки йо (23) Приоритет

С 12 0 13/Об

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий

Опубликовано 230780, Б оллетень Но 27

Дата опубликования описания 23,0780 (53}УДК 888. 334 (088. 8) (72) Авторы изобретения

A.Ô. Молин и Е.P. Рошаль

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (71) Заявитель

/ (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА

1Ъ т

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу выделения L-триптофана иэ растворов.

Известен способ выделения L-трип. тофана с помощью активированного угля (1) . Однако этот способ малоэффективен и имеет существенные недостатки,свяэанные, например, с трудностью десорбции L-триптофана с активированного угля.

Известен также ионообменный метод выделенйя L-триптофана с использованием синтетических ионитов (2) . К недостаткам указанного метода можно от- 5 нести то, что в нем предусмотрена очистка триптофана лишь от других аминокислот, а сорбционная емкость. сорбентов по отношению к тритттофану используется неэффективно.

Наиболее близким техническим ре® вв вк втт Юейибй Уй своей сущности и достигае4 : мому. эффекту является способ выделе=/ / ния L-триптофана из растворов пУтем 25 — десорбции полученного элюата и кри-

"" алли :э:ации P) . вввев и,„щ,„ ор ируют на полистирольном cCeb@oкатионите или высокоосновном анионите. Примесные аминокислоты удаляют, со смолы пропусканием раствора минеральной соли. Десорбируют триптофан раствором щелочи или аммиака (в случае катионитов) или минеральными кислотами (в случае анионитов).L-триптофан выделяют иэ элюатов путем многократного упаривания последних с последующей кристаллизацией и перекристаллизацией.

Недостатком этого способа является то, что он позволяет в основном отделить L-триптофан от других аминокислот, что ограничивает его возможности при выделении L-триптофана из растворов, содержащих значительные количества иных примесей, например, минеральных солей, окрашенных соединений. Как и в способе (21 сорбционная емкость ионитов используется неэффективно, контакт сорбентов с растворами, содержащими в больших количествах окрашенные и другйе примеси, приводит к необратимой потере . обменной емкости сорбентов и ухудшению их работы от цикла к циклу, затрудняет элюирование L-триптофана сорбентов. Для получения высокочис749889 того продукта применяют такие трудо емкие и энергоемкие операции как многократное упаривание, криСталли зацию и перекристаллизацию. Выход .- триптофана 1 около 50% недостаточно велйк. Указанные недостатки затрудняют использование этого способа в промышленности.

Целью изобретения является разработка более эффективного и техноло гичного способа выделения L-триптофана из растворов, содержащих большое количество минеральных и органических примесей, который позволил бы получать L-триптофан в промышленных условиях с высокой чистотой и с высоким выходом.

Поставленная цель достигается тем, что сорбцию L-триптофана осуществляют на макропористом слабоосновном анионите, а после десорбции с анионита из полученного элюата L-триптофан повторно сорбируют на сульфокатионите в Н-форме с последующей десорбцией L-триптофана с катионита.

При этом для десорбции L-триптофана с анионита используют обессоленную воду и/или растворы минеральных кислот в концентрации 0,1-0,5 М при температуре 10;25ОС. Для десорбции триптофана с катионита применяют

1,5-3,0% раствор аммиака в водном растворе этанола при температуре 4070 С.

Согласно предлагаемому способу кристаллизацию триптофана из аммиачНо-спиртдвых элюатов целесообразно осуществлять путем подкисления последних уксусной кислотой до рН 3,54,0 с последующим охлаждением до 05 С

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Содержащую L-триптофан культураль ную жидкость пропускают через колонку с макропористым сорбентом (например, ИА-1р). При BToM L-триптофан сорбируется, тогда как минеральные соли, другие аминокислоты и неионогенные компоненты питательной среды неароматического характера практически не поглощаются смолой. Во избежание заиливания сорбента И седиментации микробных клеток в колонне раствор в колонку подают в- направлений снизу вверх. С другой стороны, такой способ подачи раствора сущест венно улучшает динамику сорбции

L-триптофана и исключает слеживание смолы. Диапазон оптимальных значений рН подаваемого раствора от 1,0 до 7,0.

По окончании сорбции колонка с сорбентом промывается .водой.

В случае наличия окрашенных примесей в исходном растворе элюцию L-триптофана следует .проводить водой при комнатной температуре с одновременной подачей триптофансодержащего элюата

"на колонку с, сульфокатионитом (КУ-2-8, дауэкс 50W) в H-форме. При десорбции с анионита раствор пропускают через колонку сверху вниз, а при сорбции на сульфокатионитЕ снизу вверх. Благодаря отсутствию минеральных солей и целЬго ряда других примесей сульфокатиониты поглощают триптофан с высокой эффективностью.

Одновременно с концентрированием происходит дальнейшая очистка триптофана от окрашенных примесей. Для повыщения чистоты конечного продукта осуществляют промывку катионита в колонне горячей водой при температу- ре 50-90 С.

Элюцию триптофана с катионита проводят 1,5-3,0Ъ раствором аммиака в водном растворе этанола при 50-70 С.

Этот способ элюирования позволяет избежать кристаллизации десорбированного триптофана в колонке и осущест.вить ее в приемнике фракций злюата, не прибегая к многократному упариванию элюата. Во фракциях с содержа25 нием триптофана более 10 г/л при охлаждении и нейтрализации в уксусной кислоте происходит кристаллизация -триптофана. Выпавшие кристаллы, содержащие L-триптофан, уксусную кислоту и воду, отфильтровывают, промывают этанолом и высушивают в вакууме о при температуре порядка 50 С.

Уже на этом этапе способ позволяет получать продукт с содержанием основного вещества порядка 99Ъ и выходом около 50%.

Кристаллический продукт может быть подвергнут дополнительной очистке известным методом, включающим обработку активированным углем и перекристаллизацию из водноэтанольных растворов.

Фракции аммиачного злюата могут быть обработаны известными методами, включающими упаривание, кристаллизацию и перекрйсталлизацию или возвращены на стадию сорбции на анионите последующего техйологического цикла.Таким образом, общий выход кристаллического .L-триптофана может быть () увеличен до б0-70%.

По предлагаемому способу L-триптофан.получают со следующими характеристиками: выход кристаллического

L-"òðèïòîôàíà 50-70%, содержание основного вещества не менее 99%, удельное оптическое вращение +30-31 (c=1, о

Н О), влажность не более 1,0%, золь-ность (сульфатная) не более 0,1%, содержание примесей: сульфаты не более 0,013, хлориды не более 0,01%, 6Î железо не более 0,001%, тяжелые металлы не более 0,001%. Продукт не содержит примесей других аминокислот, йетоксичен и непирогенен.

Способ поясняется следующими при-,.

65 мерами.

749889

Пример 1. 2 л раствора со-. яяонну со смолой КУ-2-8 промывают ф б держащего 16 r L-триптофана„ 8,4 г " . О,5 л воды при температуре 70 С со

L-аланина, 5,6 г глицина, 7,0 г ва- . скоростью 0,2 л/час. лина, 10 г лизинхлоргидрата и 4 г Элюирование триптофана со смолы

L-глутаминовой кислоты, подают на КУ-2-8 проводят 0,5 л 1,5Ъ раствора

:KoJIoHHy c HA-1р (объем смолы 0,45 л) 5 аммиака в 50Ъ водном растворе этанов направлении снизу вверх со ско- ла при температуре 58 С, Элюат собиростью 0,5 л/час. После обнаружения рают по Фракцйям. Первая фракция

L-триптофана в. Фильтрате (пропуще- объемоМ 100 мл содержит триптофан в но 1,85 л) фильтрат подают на вторую концентрации 0,15 г/л. Эту фракцию . колонну с HA-1р (объем смолы 0,1 л). 0 направляют на стадию сорбции на смоКолонны промывают 0,85 л воды ле HA-1p в последующем цикле. Вто(до обнаружения L-триптофана на вы- Рая фракция объемом 70 мл содержит ходе из второй колонны), после чего триптофан в концентрации 48 г/л. Эту проводят десорбцию 0,2 н НСЪ с обеих фракцию обрабатывают 5,0 мл ледяной . колонн, пропуская раствор в направле- Уксусной кислоты до РН 4,10 и охлажнии сверху вниз со скоростью .. дают до 5 С. Выпавшие кристаллы отО

0,35 л/час. Одновременно элюат подают деляют фильтрованием, промывают этана колонну с Ку-2 в Н-форме (объем - . иолом и высушивают в вакууме. В ресмолы 110 мл) в направлении снизу . зультате получается 3,0 2 г кристалливверх. Элюцию кислотой прекращают . ческого триптофана, хроматографически после прохождения 7 л раствора. Элю-.. 20 чистого с содержанием основного вецию 1 -триптофана с Ку-2 проводят щества 99Ъ. Выход L-триптофана в кри2,0Ъ раствором аммиака в 50Ъ раство- сталлическом продукте составляет ре этанола при температуре 63 С, по- 48 ° 4Ъ- Содержание триптофана в мадавая раствор сверху вниз со ско- точном растворе составляет 5,2 г/л, ростью 80 мл/час. Первую Фракцию Я объем маточного раствора 65 мл, а объемом 90 мл отбрасывают. Вторую вместе с промывными водами 80 мл. фракцию объемом 250 мл, содержащую Этот раствор после отгонки спирта (.-триптофан в концентрации более подают на стадию сорбции на смоле

7,0 г/л, обрабатывают 20 мл ледяной И 1Р в последующем цикле. Третья уксусной кислоты до РН 4,5 и охлаж- 30 Фракция элюата объемом 350 мл содердают в течение 20 час при температу- жит триптофан в концентрации 4,2 г/л. ре 3-5 С.. Выпавшие кристаллы отфильт- Эту Фракцию Упаривают в вакууме до ровывают, промывают охлажденным эта- бъема 18 мл и охлаждают при 5 С. об а 18 о нолом и высушивают при 40 С. . Выпавшие кристаллы триптофана отдеВ результате получают -11,9 r крис-35 ляют Фильтрованием, про вают этаноталлического L-трилтофана с содержа- -лом и высушивают. В результате полунием основного вещества более 99Ъ. чают 1,15 г триптофана с содержанием основного вещества 95Ъ. Общий

Пример 2. Исходным матерна выход триптофана в кристаллическом лом для выделения L-триптофана явл" продукте составляет 66Ъ. Маточный ется Ферментационная средами получен 40 раствор после кристаллизации триптоная в результате культивирования фана из третьей фракции элюата возштамма Вас. s Р s ВНИИгенети вращают на стадию сорбции на смоле ка 3557 на питательной среде, сойеР- HA-1 в последующих циклах. жащей сахар, кукурузный экстракт, мо-. чевину, соли фосфориокислого калия, 45 Пример 3- Культуральная жидсернокислый магний, хлористый натрйй. кость та же, что в примере 1. Объем

Концентрация L-триптофана 6,20. г/л. культуральной жидкости 2,6 литра.

1 литр культуральной жидкости подают . Объем анионита HA-1p составляет 0,5 л, на колонну со смолой HA-1p объемом Условия сорбции и десорбции трипто0,25 л снизу вверх со скоростью у Фана в случае смолы ИА-1р аналогичны условиям примера 1 за исключением то0,5 л воды в том же направлении с го, что промывку колонны .после сорбтой же скоростью. После пропускания ции производят 1,0 литром воды, а первых 0,2 л воды и обнаружения в элюцию трийтофана с анионита 6,0 литвыходящем РаствоРе триптофана в сле- 55 p воды., p ми во ы. Элюат содержащий триптодовых концентрациях выходящи ц р иях выходящий раст- фан, минуя промежуточную емкость, пос сулькатионитом вор направляют на вторую колонну со дают на колонну с су смолой ИА-1р (объем смолы 250 мл). Дауэкс 50Чх4 20/50 mesh в Н-форме, взятым в объеме 70 мл снизу вверх со

Десорбцию -триптофана с первой клонны осуществляют 3,0 л воды, по- скоРостью i / ско остью 0 2 л/час. По окончании даваемой со скоростью ю 0 2 л/час в 0 сорбции триптофана колонну с сульфонаправлении сверху вниз.. Элюат, со- катионитом промывают 0,5 л воды при держащий триптофан, пропускают с той TeM„ep УР темпе ат е 75 С в направлении сниз вве х со скоростью 0,2 л/час.

Элюи ование триптофана со смолы же скоростью через коЛонну с 80 мл . зу вверх Р к

Wx п ово ят 0,5 л 1,7Ъ сульфокатионита Ку-2-8 в Н-форме в . Элюирова е р Ф направлении снизу вверх. Затем ко- 45,Дауэкс 50 х4 пр д

749889

Формула изобретения

Составитель В. Максимова

Редактор H. Козлова . Техред Ж. Кастелевкч Корректор C. Шекмар

ЙГм 4ю:Йы" = ". йеы -

Заказ 4556/19 Тираж 522 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 раствора аммиака в 50% водном растворе этанола при. температуре 63 С. Первую фракцию объемом.70 мл, содержащую триптофан в концентрации 0,20 г/л, направляют .на стадию сорбции на анионите .ИА-1р в последующем цикле. Вторую фракцию элюата с сульфокатионита объемом 90 мл,содержащую триптофан в концентрации 80,5 г/л, обрабатывают 5,5 мл ледяной уксусной кислоты до рН 4,15 и охлаждают до 50 С. Выпав- О

;:roe кристаллы обрабатываЮт так же, как в примере 1. В результате полу чают 6,55 г кристаллическОго L-триптофана, хроматографическй чистого, с содержанием основного вещества 99%. 15

Выход -триптофана в кристаллическом продукте составляет 51,2%. Маточный растВор объемом 78 мл с "содержанием триптофана 5,1 г/л и промывные воды после отгонки спирта возвращают на стадию сорбции на анионите ИА-1 в последующем цикле. Третью Фракцию элюата объемом 315 мл .с содержанием триптофана в концентрации 6,5 .г/л упаривают до объема 30 мл и охлаждают при

5 С. Вьшавшие кристаллы отделяют 25 фильтрованием, промывают этанолом и высушивают., В результате получается

1;98 г кристаллического триптофана с содержанием основного вещества 96%.

Общий выход триптофана в кристал- ЗО лическом продукте составляет 67,2%.

Кристаллы триптофана с содержанием основного вещества 96Ú перекристаллизовывают. Для этого 2,25 г три птофана растворяют в 25 мл 50% эта- Я нола при нагревании. В раствор добавляют 0,4 г активированного угля, горячий раствор фильтруют, Фильтрат охлаждают и выпавшие кристаллы триптофана отфильтровывают, промывают,ц этанолом и высушивают. В результате получают 1,56 г триптофана, хромато- графически чистого, с содержанием основного вещества 99%. Выход на стадии перекристаллизации составляет 72% 45 в пересчете на триптофан с содержанием основного вещества 100%;

1. Способ выделения L-триптофана из растворов путем сорбции его на ионообменных смолах, десорбции полученного элюата и кристаллизации, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности про цесса, а также получения готового продукта, свободного от примесей, сорбцию L-триптофана осуществляют на макропористом слабоосновном анионите, а после десорбции с анионита из полученного элюата L-триптофан повторно сорбируют на сульфокатионите в Н-Форме с последующей десорбцией -триптофана с катионита.

2. Способ по н. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что десорбцию L-триптофана с анионита осуществляют обессоленной водой и/нли растворами минеральных кислот в концентрации 0,10,5 М при температуре 10-25 .

3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что десорбцию L-триптофана с катионита осуществляют 1,53,0% раствором аммиака в водном растворе этанола при температуре 40-70ОC.

4. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что кристаллизацию

L-триптофана из аммиачно-спиртовых элюатов проводят путем подкисления последних уксусной кислотой до рН

3,5-4,0 с последующим охлаждением до 0-5 C.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США Р 2.416.956, опублик. 1947.

2. Патент США Р 2.700.672, опублик. 1955.

3. Патент США Р 3.450.712, опублик. 1969 (прототип).