Способ определения антивируснойактивности химических веществ

Способ определения антивируснойактивности химических веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскик

Социалистические

Республик

ОП ИСАНИЕ(753142

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 11. 05. 78(21) 2613873/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (51)М. Кл.

С 12 К 1/00 аввудерстевнеы11 квмвтет

СССР ию делам ваввретенне

N втармткв

Опубликовано 07.08.81. Бюллетень ¹ 29

Дата опубликования описания 09.08.81 (53) УДК 576.8. .093.23(088.8) (72) Авторы изобретения

Г. А. Королева и В. А. Лашкевич

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов Академии медицинских наук СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ

ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ 1 ю

Изобретение относится к микро" биологии и может найти применение в фармацевтической промышленности для изыскания средств, обладающих противовирусной активностью.

Известен способ определения антивирусной активности химических веществ путем заражения лабораторных животных вирусом и введения исследуемого вещества с последующей оценкой результатов 1!1 . то

Недостатками известного способа определения антивирусной активности препаратов являются длительность (42 дня) и высокая стоимость экспери3$ мента, связанная с большим расходом животных, так как для оценки эффективности одного препарата необходимо 120 мышей. Способ очень трудоемок„ требует ежедневного двухкратного введения препарата большим группам животных в течение 5 дней и обеспечивает низкую чувствительность вследствие применения в качестве энтеровирусной модели жш иного вируса энцефаломиокардита.

Действие исследуемого препарата на мышиный вирус энцефаломиокардита может быть не идентично его действию на энтеровирусы человека.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа и упрощение его. ,Цель достигается тем, что животных заражают светочувствительным вакционным штаммом полиовируса человека, выращенного в культуре клеток в присутствии профлавина, и по наличию светорезистентного потомства исходного вируса в тканях инфицированного животного определяют антивирусную активность.

В качестве лабораторнъпс животных используют новорожденных хлопковых крыс.

Способ осувтествляют следующим образом.

Приготавливают рабочий вирус. Фотосенсибилизацию полиовируса производят путем 3-4 серийных пассажей в культуствительных вирусных частиц и с низким содержанием или отсутствием све резистентных вирусных частиц является пригодным для проведения эксперимен тов на животных. Вирус разливают и, 1,0-2,0 мл в инсулиновые флаконы, обернутые в фольгу, и хранят при

-20 С. Приготовленный рабочий вирус ч может быть использован в течение двух лет.

Эксперименты на животных.

Светочувствительный вирус в количестве 1 г — 10 БОЕ в объеме 0,1 мл

-,5 65 вводят IIOpKOKHO 30-50 XJIO IKOBblM Kpb»сам в возрасте 2-3 дней. Половина животных (15-25 крыс) дополнительно к вирусу получает 3-4 инъекции исследуемого препарата. Препарат в субтоксической дозе вводят крысам подкожно в дозе 0,1 мл за сутки до заражения, в день введения вируса и в течение

1-2 дней после введения вируса. Другая — контрольная группа животных (15-25 крыс) в дополнение к вирусу получает не препарат, а только растворитель препарата в тех же объемах.

Через 2 ч после заражения и затем ежедневно в течение 4 дней производят забой по 3-5 сосунков хлопковых крыс из группы животных, получавших только вирус, и по 3-5 сосунков из группы животных, получавших вирус и препарат.

Из забитых крыс готовят 10Х-ные тушковомозговые суспензии. Суспензии во »лаконах, обернутых в фольгу, замораживают, оттаивают и центрифугируют.

Надосадочную жидкость титруют в темноте и параллельно после облучения лампой дневного света. В контрольной группе животных, которая получала только светочувствительный вирус, происходит размножение этого вируса, протекающее без клинических симптомов заболевания и выражающееся в образовании светорезистентного вирусного поз,о томства в титре до 10 -10 БОЕ на

1 мл суспензии.

В группе животных, получавших светочувствительный полиовирус и препарат, вызывающие подавление размножения вируса, светорезистентного вирусного потомства не будет, и титр светореэистентного вируса будет оставаться на нуле в .течение всего периода наблюдения. У этой группы животных можно проследить только постепенное падение титра введенного светочувствительного вируса. Если препарат не ока

Все процедуры с вирусом (слив, заражение) проводят при сумеречном осве40 щении.

После 3-4 пгссажей с профлавином культуральную жидкость титруют методом бляшек. Параллельно проводят тит45 рование необлученного вируса при сумеречном освещении и титрование предварительно облученной порции того же вируса — при обычном освещении. Для облучения берут небольшое количество (0,5-0,7 мл) культуральной жидкости

50 из общего пула вируса и выдерживают

15-20 мин под лампой дневного света при 4000 люкс. Титр необлученного вируса при титровании в темноте должен быть 10- -10 БОЕ/мл, титр того же

Т6 55 вируса после об::учения должен быть не более 10 -10 БОЕ/мл. Такой пул вируса с высоким содержанием светочув3 75314 ре клеток в присутствии 2,5 мкг профлавина на 1 мл поддерживающей среды.

В качестве исходных штаммов полиовируса может быть взят любой из трех вакцинных штаммов (LSC2ab, Р712, Ch2ab, Leonl2аЬ) полиовируса 1, II, 111 типа. Пассажи вируса с профлавином проводят в первичной культуре клеток почки обезьяны или в любой перевиваемой культуре клеток (Ке1а, 10

Не-р-2), восприимчивой к полиовирусной инфекции. После удаления среды роста в пробирки с монослойной куль турой клеток наливают по 1,5 мл поддерживающей среды с профлавином. Про- 15 бирки инкубируют во вращающемся бара1бане 30-60 мин при 36-37ОС и затем обертывают фольгой. Затемненные пробирки заражают штаммом полиовируса в количестве 10 -10 БОЕ/0,1 мл и помещают в барабан при 35 0,5 С. На следующий день из барабана берут 2 — 3 зараженные пробирки, снимают с них фольгу и просматривают под микроскопом.

Эти же пробирки, уже больше не покры- 5 вая их фольгой, используют для дальнейшего наблюдения за развитием цитопатического эффекта. При наступлении вирусной дегенерации в пробирках, находящихся под наблюдением, эти пробирки выбрасывают. Остальные, находящиеся в барабане зараженные пробирки, вынимают завернутыми в фольгу и замораживают. После оттаивания культуральную жидкость сливают во флакон, обернутый фольгой, и используют для по следующего пассажа вируса с профлавином.

5 75314 зывает антивирусного действия, то у животных, получавших этот препарат, также как и у животных контрольной группы, происходит образование светорезистентной популяции полиовируса до

10 -10 БОЕ/мл.

q,î

Определение эффективности препарата, включая эксперименты на животных, приготовление суспензий и титрование вируса методом бляшек продолжается

8 — 12 дней.

Предлагаемый способ позволяет значительно увеличить точность и воспроизводимо т результатов испытания противоэнтеровирусной активности химичес- ких веществ, так как определение тчтрч вируса в контрольной и опытной группах животных проводится очень точным методом бляшек, а не по выживанию зараженных животных. Кроме того, при использовании предлагаемого метода в одном опыте получаются статистически значимые результаты и нет нужды в повторении опытов, которое часто необходимо из=за недостаточной точности и 5 низкой воспроизводимости опытов, основаных на выживании животных.

Предлагаемый способ позволяет значительно сократить сроки оценки активности препарата с 42- до 8-12 дней.

Предлагаемый способ дешевле, так как требует 30-50 сосунков хлопковых крыс для оценки одного препарата в отличие от существующего способа, который требует 120 взрослых белых жппей. Расход сосунков хлопковых крыс может быть сокращен при проведении оценки одновременно несколЬких препаратов, поскольку группа животных (15-25 сосунков), получающая только вирус, может служить 4О контролем одновременно для нескольких групп животных (по 15-20 сосунков), получающих как вирус, так и испытуемый препарат.

Предлагаемый способ позволяет вести отбор препаратов, обладающих антивирусным действием, непосредственно против энтеровируса человека, а именно против полиовируса, а не против мышиного энтеровируса — вируса энцефаломиокардита.

Предлагаемый способ, основанный на использовании вакционных штаммов полиовируса, безопасен для людей и доступен для работы во всех энтеровирусных лабораториях.

Формула изобретения

l. Способ определения антивирусной активности химических веществ путем заражения лабораторных животных вирусом и введения исследуемого вещества с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и упрощения его, животных заражают светочувствительным вакционным штаммом полиовируса человека, выращенного в культуре клеток в присутствии профлавина, и по наличию светорезистентного потомства исходного вируса в тканях инфицированного животного определяют антивирусную активность.

2. Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что, в качестве лабораторных животных используют новорожденных хлопковых крыс.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

I. J. "Chemotherapy", 1974, 20, р. 235-244.

Составитель С. Малютина

Редактор О. Кузнецова Техред М.Рейвес Корректор Л. Иван

Заказ 5846/45 Тираж 528 Подписное,. ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4