Способ получения пептидов
Патент 753358
Авторы
Классы МПК
Способ получения пептидов
Иллюстрации
Реферат
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Союз Советскнк
Соцнаннстнческнх
Республик
К ПАТЕНТУ ((>>) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 260977 (21) 2526421/23-04 (51) й. Кл. (23) Приоритет (32) 27 ° 09 ° 76
20.06.77
807849 (:« >) США
С 07 С 103/52//
A 61 К 37/02
Гоеударстееииый комитет
СССР по делам изобретений и открытий (53) УЛК 547 ° 964. . 4.07 (088. 8) Опубликовано 300780.Бюллетень >ЧЪ 28
Лата опубликования описания 300780 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Эдвард Ли Смитвик-младший (США), Роберт Теодор Шуман (США) и Роберт Куртис Артур Фредериксон (Канада) Иностранная фирма
"Эли Лилли энд Компани" (США) (7l) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ СОЛЕ>> (Ц 0" (0) 0
0 R 0
II Ii I и м- сн — с -н-сн-с-тщ-сн-с-м- сн- с - 2-сн- Т, 1- I 15 1 ! сН з
CHà
ОН
0СН где R = R = 8 — водород;
2 3
R Сз -С4 — алкил;
Изобретение относится к способу получения пептидов или их солей новых соединений, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине.
В пептидной химии широко используют метод получения пептидов путем деСлокирования соответствующих защищенных пептидов в безводной кислой среде (11.
R -- R = R т — независимо водород или метил, М= — СН1$СНз > — SCHgCHy > — CH(CHg)g
Цель предлагаемого изобретения— получение новых пептидов, обладающих фармакологическими свойствами, с использованием известных методов пептидной химии.
Поставленная цель достигается описываемым способом получения нептидов общей формулы
z =- — с — нн
2>
Н
0 или их солей, заключающийся в том, что в соединении формулы tl
753358 где Й вЂ” й,е1-ире тгбутилоксикарбонил ;
R -R, Z u W имеют указанные т выше значения, отщепляют защитные группы в безводной кислой среде.
Процесс предпочтительно проводят в трифторуксусной или ледяной уксусной кислоте с газообразным хлористым водородом или в 98%-ной муравьиной кислоте.
Пример 1. Приготовление хлоргидрата L-тирозил-0-аланилглицил-L-фенилаланил-Ф- L-метиониламида.
А. Бензил-D-алинат-и-толуолсульфонат. К смеси 100 мл бензилового спир— та и 200 мл бенэола, содержащего
55,1 г (0,29 моль) моногидрата и-То луолсульфокислоты добавляют 25 r (0,281 моль) 0-аланина. Смесь доводят до кипения с обратным холодильником и воду удаляют с помощью прибора Дина-Старка. Смесь нагревают 15 ч, затем охлаждают до комнатной температуры и разбавляют эфиром.Образовавшийся осадок собирают и перекристаллизовывают из смеси метанола и эфира. Получают 55,3 r (56%) целевого соединения, т.пл. 112-115 С. о
Найдено,Ъ: С 58,19; H 6,06; и 3,82.
С Н1 ИО S ° (351, 42)
Вйчислено,Ъ: С 58,10;Н 6,02; и 3,99.
Б. Бензил N -пъра бутилоксикарбонил-О-бензил- -тирозил-D-алинат.
К 200 мл безводного N,N-диметилформамида добавляют 35,1 г (0,1 моль) продукта части. А, Полученную смесь охлаждают при перемешивании до О С и добавляют 11,2 г (0,1 моль) диаэабкциклооктана. Перемешивание продол0 жают еще в течение 10 мин при О С и добавляют 37,1 r (0,1 моль) и
- mpem-бутилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозина, затем 13,5 г (0,1 моль)
1-оксибенэотриазола и 20,6 г (0, 1 моль) й,й-дициклогексилкарбодимида.
Полученную смесь перемешивают
3 ч при О С, затем при комнатной температуре 24 ч. Вновь охлаждают до 0©С и суспензию фильтруют, фильтрат концентрируют в вакууме.
Остаток растворяют в этилацетате и тщательно промывают раствором бикарбоната натрия, водой, 0,75 N холодной лимонной кислотой и вновь водой. Органический слой отделяют, высушивают над сульфатом магния, фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в горячем этаноле. При охлаждении из раствора выпадают кристаллы, после перекристаллиэации которых из этанола получают 41,5 г (80%) чистого целевого соединения т.пл. 121-123 С.
Найдено,Ъ: С 68,99, Н 6,75;
20 N 5,17.
С,Н„И, О, (520 63)
Вычйслено,Ъ: С 69,21, Н 6,97;
И 5,38.
В. И -а Рев-Бутилоксикарбонил-О25 -бензил-L-тИрозил-0-аланин.
К смеси 200 мл тетрагидрофурана и 20 мл воды добавляют 31,2 г (0,06 моль) продукта части Б.Раствор охлаждают до ОоС и к нему медленно добавляют 13,2 мл (1,1 эквив.)
5N раствора гндроокиси натрия.
При перемешивании смесь медленно нагревают до комнатной температуры.
Через 5ч смесь распределяют между водой и эфиром. Водный слой отделяют, охлаждают и устанавливают рН 2 при добавлении лимонной кислоты. Затем продукт экстрагируют этилацетатом.
Экстракт промывают водой, сушат над сульфатом магния, фильтруют и раз4О бавляют эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают, получают 17,7 r (67%) целевого соединения;т.пл. 160162оС
Найдено,%: С 64,73; H 6,70;
45 и 6,20.
С Н И 06 (442,51) °
Вычйслейо, Ъ: С 65, 14; Н 6, 83;
И 6,63.
Г. Бензил N -ape -бутилоксикарбо50 HHII-0- eH3HII-L-THpo3HJI-0-аланилглицинат.
Смесь из 70 мл безводного диметилформамида, 6,74 r (0,02 моль) соли бензилглицината и и-толуолсульфокислоты охлаждают до О С и добаво ляют 2,24 г (0,020 моль) диазабициклооктана. Смесь перемешивают несколько минут и добавляют к ней
8,84 г (0,.020 моль) продукта части В, а затем 2,7 г (0,020 моль) фЯ 1-оксибенэотриаэола н 4,12 (0,020 моль) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при ОоС, а затем 24 ч при комнатной температуре. Суспензию ф5 охлая(дают до О С, фильтрУют и фильт753358
5 а
65 рат концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате. Промывают последовательно 1N раствором бикарбоната натрия, водой, холодной
0,75N лимонной кислотой и водой.
Органическую фазу отделяют, высушивают над сульфатом магния, фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме.
Остаток кристаллизуют из этанола, получают 10,8 г (92Ъ) чистого целевого соединения, т.пл. 145-147 С.
Найдено,Ъ: С 67,32; Н 6,83;
N 6,91.
СзьНз 44з От (589, 69) .
Вычислено, Ъ: С 67, 22; Н 6, 67;
i4 1, 13.
Qh
Д. N -mp -Áóòèëîêñèêàðáîíèë-L-тирозил-0 -аланилглицин.
К 60 мл диметилформамида добавляют 10,5 г (0,018 моль) продукта, полученного как описано в части Г, затем 2,5 г 5Ъ-ного палладия на угле в виде суспензии в диметилформамиде.
Полученную смесь продувают азотом, водород вводят по трубке при атмосферном давлении и комнатной температуре. Через 3,5 ч подачу водорода прекращают и фильтрованием удаляют катализатор. Фильтрат концентрируют в вакууме. При обработке остатка эфиром получают 5,4 г (75Ъ) целевого соединения в виде аморфного твердого вещества.
Найдено,Ъ: С 70,08, Н 5,82;
М 6,16.
СЫН2ВИ 0> (446,65).
Вычислено, -.: 69, 94; Н 5, 87; и 6,27.
0 ф
Е. N -mpe -Бутилоксикарбонил-Ы
-метил-L-метиониламид.
QL
Дициклогексиламиновую соль И вЂ” ре -бутилоксикарбонил- -метионина (17,2 r, 0,04 моль) распределяют между этилацетатом и холодной
0,75 И лимонной кислотой. Органическую фазу отделяют, промывают водой, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме до маслообразного остатка. Остаток растворяют в смеси 80 мл безводного тетрагидрофурана и 10 мл диметилформамида и добавляют 0,5 r 18-кроун-б-эфира.
Суспензию гидрида калия (эквивалент О, 12 моль) при перемешивании добавляют по каплям к полученной холодной смеси в течение 30 мин.
Затем вводят йодистый метил (2,49 мл;
0,04 моль) и смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре. Охлалщенную реакционную смесь подкисляют
0 75 N лимонной кислотой до рП 3 и распределяют между водой и эфиром.
Эфирный слой промывают несколько раз водой и экстрагируют 1 и раствором бикарбоната натрия. Водные экстракты объединяют, подкисляют до рН 2 и экстрагируют этилацетатом. Экстракт сушат над сульфатом магния, фильтруют и упаривают в вакууме. Получают 8,4 r продукта, имеющего спектр ЯИР,соответствукщий желаемому й-метилированному продукту: Ю 2,92, К вЂ” СН ., Ф 2,11, S-СНъ, б -1,6, С(СН )з .
Масло (8,4 г примерно 0,034 моль) растворяют в 60 мл диметилформамида.
Раствор охлаждают до 0 С и добавляют
4,69 r (0,035 моль) оксибензотиазопа и 7,0 г (0,034 моль) дициклогексилкарбодимида. Смесь перемешивают 2 и при 0 С и барботируют через нее безо водный аммиак в течение 45 мин.Затем реакционную смесь фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток вводят в колонку с силикагелем (0,076-0,252 мм) размерами 3 х 50 см.
Для злюирования используют хлороформ, смесь (9,75:0,25) хлороформа и метанола. Фракции, полученные при хроматографировании объединяют на основе результатов анализа хроматографией в тонком слое и концентрируют в вакууме, получают после двойной перекристаллизации (из смеси эфира и петролейного эфира) целевой продукт (4,1 г), т.пл. 75-78 С.
ЯМР: б 2; 80, N-СНз, б 2, 10, S-СНЪ, (y 1,48, С(СН ), Я -29,5 (С = 0,5, хлороформ).
Найдено,Ъ: С 50,59; Н 8,24;
N 10,87, С4 Н Н .S0З (262 37
Вйчислено, Ъ: С 50, 36; Н 8, 45;
N 10, 68.
Ж. N --rnpem-Бутилоксикарбонил-L 9
-фенилаланил-N -метил- -метиониламид.
Через смесь из 20 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мп анизола, 2 мл триэтилсилана и 3,6 r (0,0144 моль) продукта, полученного в условиях,описанных в части Е, барботируют безводный хлористый водород в течение
30 мин. Затем смесь разбавляют эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают, сушат (2,9 г) и вновь растворяют в 40 мл диметилформамида.
Раствор охлаждают до 0 С и добавляют к нему 2,9 мл (0,0146 моль) дициклогексиламина, а затем 1,97 г (0,0146 моль) оксибензотиаэола, 3,87 r (0,0146 моль) N - гпрее-бутилоксикарбонил-1-фенилаланина и 3,0 г (0,0146 моль) дициклогексилакарбодиимида. Полученную смесь перемешивают 2 ч при 0ОС, а затем 24 при комнатной температуре. Вновь охлаждают до 0 С, фильтруют, фильтрат коно центрируют в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и раствор пгомывают последовательно 1 и раствором бикарбоната натрия, водой, 0,75 М лимонной кислотой и водой. Этилацетатный раствор сушат над сульфатом магния, упаривают в вакууме, получают масло, которое не кристаллизуется иэ петролейного эфира. Остаток вводят в колонку (Зх50 см), заполненную си753358
40 ликагелем и продукт элюируют хлороформом, смесью хлороформа и метанола (9,8 : 0,2). Из фракций, объединенных в соответствии с результатом анализа методом хроматографии в тонком слое, после упарива- 5 ния получают остаток, который после перекристаллизации из смеси эфира и петролейного эфира дает 3,1 г (52,5Ъ) целевого соединения, т.пл. 99-103 С. !
О
Найдено,%: С 59,74", Н 7,47;
М. 10,45.
С ©НЗ М 04 Ь (409,55).
Вычислено,%: С 58,65, Н 7,63;
N 10,26.
3. М â€” mpem-Бутилоксикарбонил-L-тироэил-0-аланилглицил-L-фенилаланил-й -метил-L-метиониламид.
К смеси 20 мл ледяной уксусной кислоты, 3 мл анизола и 3 мл триэтилсилана добавляют 2,2 r (5,37 моль) продукта, полученного в условиях, списанных в части Ж.
Через смесь пропускают в течение
30 мин безводный хлористый водород.
Затем добавляют эфир, выпавший оса- 25 док отфильтровывают и сушат в вакууме.
Твердое вещество (1,75 г,5 моль) растворяют в 30 мл без водного диметилформамида и смесь охлаждают до
О С. Хлористоводородную соль нейтра- 30 лиэуют при добавлении 0,99 мл (5 . моль) дициклогексиламина.Через
5 мин вводят 2,05 г (5 моль) продукта,полученного в условиях,описанных в части Д, а затем 0,68 г 35 (5 моль). оксибензотиазола и 1,03 r (5 моль) дициклогексилкарбодиимида.
Смесь перемешивают 24 ч при 4 С.
Полученный нерастворимый продукт отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате, раствор промывают последовательно 1 N, водным раствором бикарбоната натрия, холодной
0,75 М лимонной KHcJIoToA H водой.
Раствор сушат над сульфатом магния, вносят в колонку (Зх50 см) с силикагелем и продукт элюируют хлороформом, а затем смесью хлороформа и метанола (9:1). Фракции объединяют, анализируют методом хроматографии в тонком слое, упаривают, получают две порции сырого продукта весом
0,80 и 1,2 г. Первую порцию дополнительно чистят хроматографией в тонком слое силикагеля (хлороформ- 55 метанол 9:1) и получают 0,62 r целевого соединения в виде аморфного твердого вещества.
Найдено,Ъ: С 58,48; Н 6,64;
М 11,97. 60
СРН4ЬМ6 08 S (700, 86 ).
Вычислено,Ъ: С 58,27, Н 6,90, М 11,99.
Анализ аминокислоты: Найдено Т у r
099, А(а 100, GK у 100; Phe 100. 65
Вторую порцию продукта дважды хроматографируют тем же методом и получают 0,74 r целевого продукта, имевшего приведенный элементарный анализ и анализ айинокислоты.
И. Хлоргидрат L-тирозил-0-аланилглицил-L-фенилаланил -М -метил-Lм
-метиониламида.
К 5 мл ледяной уксусной кислоты, содержавшей 0,2 мл анизола, добавляют 0,72 г (1,03 моль) целевого соединения части 3; Через смесь в течение 20 мин пропускают безводный хлористый водород, смесь сушат лиофилизацией, получают 0,74 г целевого соединения, R 0,3.
Аналитический образец продукта сушат в вакууме при температуре 100 С.
Найдено,Ъ: С 54,36, Н 6,19;
N 13,00.
C+q
Вычислено, Ъ: С 54, 56; Н 6, 49;
N 13,19.
Анализ аминокислоты: Найдено Ty r
1,01; АВа 0,99; Ы у 1,00; Phe 1,00.
Пример 2. Приготовление моноацетата полуторного хлоргидрата
L--тирозил-0-лейцилглицил-L-фенилаланил-N -метил-L-метиониламида. (А
A. Бензил-0-лейцинат-и-толилсульфонат.
Соедине ние получают в условиях, описанных в части A примера 1,для приготовления производного 0-алината.
Выход 73Ъ; т. пл. 155-156 С.
Найдено, Ъ: С 61,17; Н 6,68;
М 3,81.
С Нт N5S (393,50)
Вычислено, Ъ: С 61, 05; H 6, 92;
iN 3,56.
Б. Бензил-М вЂ .тре -бутилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозил-0-лейцинат.
К 50 мл диметилформамида добавляют 7,86 г (0,020 моль) продукта, полученного в условиях, описанных в части A. Смесь охлаждают до ООС и добавляют 2,24 г (0,020 моль)
ОАВСО. Смесь перемешивают 5 минут и добавляют7,42 r (0,020 моль)M -mPem-бутилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозина, а затем 2,7 г (0,020 моль) оксибензотиазола и 4,12 г (0,02 моль) дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают 2 ч при ООС и 24 ч при комнатной температуре. Затем смесь вновь охлаждают до О С,получено ную суспензию фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме. Полученный остаток растворяют в этилацетате, раствор промывают последовательно
1 М раствором бикарбоната натрия,водой,холодной 0,75 N лимонной кислотой и водой. Органическую фазу сушат над сульфатом магния, фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме.
Остаток кристаллизуют из горячего этанола и получают 9,0 г (78Ъ) целевого соединения, т.пл. 100-103 С.
753358
10.ния, т..пл. 189-190 С. ,Найдено,%: С 58 79; Н 7,48;
М 9,39.
С Нз и 07 (4 51, 5 2 ) ..
Вычислено, %: С 58, 52; Н 7, 37, 20 М 9,31.
Е. N< -mpem-Бутилоксикарбонил— L-тирозил — D-лейцилглицил-L-фенилаланил-N -метил-L-метиониламид.
К 10 мл безводного диметилформамида добавляют 0,692 г (0,002 моль) солянокислой соли L-фенилаланил-N -метилметиониламида (приготовлен0 ной, как описано в части 3 примера
1) и 0,903 r (0,002 моль) продукта, приготовление которого описано в части Д. Полученную смесь охлаждают до ООС и добавляют О;28 мл (0,002 моль) тризтиламина и через
10 мин 0,27 r (0,002 моль) оксибензотиазола и 0,412 г (0,002 моль) дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают 2 ч при ООС и 24 ч при 4оС. Полученный осадок отфильтровывают и фильтрат концентрируют в вакууме до образования .остатка,который растворяют в этилацетате.
Раствор промывают последовательно
1 N водным. раствором бикарбоната натрия, водой, холодной 0,75 и лимонной кислотой и водой. Органическую фазу отделяют, сушат над сульфатом магния, фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме. Хроматографируют в тонком слое и с пластинки продукт элюируют смесью хлороформа и метанола (9,25:0,75). Из каждой пластинки вырезают основную УФ-положительную полосу и продукт элюируют с силикагелем смесью хлороформа и метанола. После удаления рас ворителя в вакууме получают 1,2 r (81%) целевого соединения в виде аморфного твердого вещества,)ck) в -31,5О (C = 0,5, метанол) .
Найдено,%: С 59,88, Н 7,06; ,. N 11,15.
Зт H 54 Nà Оз 5 (742, 93), вычислено,%: С 59,88, Н 7,06;N 11 15.
Г. Бензил-N -п ре -Бутилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозил-О-лейцилгли- 35 цинат.
К смеси 3,37 г (0,010 моль) соли бензиглицината и и-толуолсульфокислоты и 1,12 г (0,010 моль) ABCO в
25 мл безводного диметилформамида 40 добавляют 4,84 г (0,010 моль) соединения,полученного в условиях, описанных в части В. Смесь охлаждают до О C и добавляют к ней 1,35 г (О, 010 моль) оксибензотиазола и
2,06 r (0,010 моль) дициклогексилкарбодиимида. Полученную смесь перемешивают 2 ч при О С и 24 ч при комнатной температуре. После охлаждения до ОоС смесь фильтруют и
50 фильтрат концентрируют в вакууме.
Остаток растворяют в этилацетате и раствор промывают последовательно
1 М водным раствором бикарбоната натрия, водой, холодной .0,75 М лимонной кислотой и водой. После сушки чад сульфатом магния раствор фильтруют . и концентрируют в вакууме. Остаток кристаллиэуют из водного этанола, получают 4,0 г (63%) целевого соединения; т.пл. 114-116оС, 60
Найдено,%: С 68,17, Н 7,12;
N -6,40.
СйьН4 йзОт (631,77).
Бйчйслено,%: С 68,44; Н 7, 18;
6,65. 65
Найдено,%: С 71,30; Н 7,15;
N 4,79.
С44Н 4М О (574,72)
Вычйслено,%: С 71 06 Н 7,37,"
N 4,87.
В. М -аурел -Бутилоксикарбонил-О-бензил-С-тирозил-б-лейцин.
К 80 мл тетрагидрофурана добавляют 8,0 г (0,0139 моль) продукта, полученного в условиях, описанных в части Б. После добавления 20 мл воды полученную смесь охлаждают до
О С и медленно добавляют к ней
7,25 мл (0,0145 моль) 2 и водного раствора гидроокиси натрия. Смесь перемешивают 30 мин при Î С и 24 ч при комнатной температуре, затем распределяют между водой и эфиром. Водную фазу отделяют, охлаждают до О С, подкисляют 1 М соляной кислотой до рН 2. Продукт экстрагируют этилацетатом. Экстракт промывают водой, сушат над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Получают сиропообразный остаток. Этот остаток кристаллизуют из смеси эфира и петролейного эфира и получают 6,4 г (95%) целевого соединения; т.пл. 90-94 С.
Найдено,%: С 67,14; Н 7,38;
М 5,76.
С2тНзьй 0 в (4 84, 59 ), Вйчислено,%: - 66 г 92; Н 7,49;
М 5,78.
Д. М -арве -Бутилоксикарбонил-LФ
-тироэил-D-лейцилглицин.
К 5 мл безводного диметилформамида добавляют 3,9 r (0,006 моль): соединения, полученного в условиях, описаннйх в части Г, и 1,5 г 5%-ного палладия на угле. После добавления
40 мл этанола смесь продувают азотом и в течение 5 ч вводят в нее водород при атмосферном давлении и комнатной температуре. Катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток кристаллизуют из смеси эфира и этилацетата, получают 2,3 г (85%) целевого соединеАнализ аминокислоты: НайДено Ту г
1,01.; Leu 1,00; Иу 1,00, Phe 0,99.
753358
30
Ж. Полуторахлористый мои оацет ат (.-тироэ ил-0-лейцилглицил-L-фенилаланил- М -.метйл- L -метиониламида.
К 5 мл ледяной уксусной кислоты, содержащей 0,3 мл анизола, добавляют
О, 900 r (0,0012 моль) соединения, получение которого описано в части Е.
Через смесь пропускают безводный хлористый водород в течение 20 мин.
Продукт сушат лиофилизацией, из уксусной кислоты получают целевое соединение в виде аморфного твердого вещества; > — 2,1 (С= О, 3, метанол).
Найдено,%: С 54,30; Н 6,64;
11,32; СЕ 6,96.
Сз Н N@Og S ° 1,5 НСЮ С Нд О (757, 04).
Вычислено,Ъ: С 53,93; H 6,79;
N 11,1О, CR 7,02.
Анализ аминокислоты: Найдено Tyr
0,99 ; ен 1,03; ОРу 0,99; РЬе 0,99.
Пример 3. Приготовление хлоргидрата L-тирозил-О-аланилглицил-L-фенилаланил-L-метиониламида.
A. Метил-Й "- »Рея-бутилоксикарбонил-L-фенилаланил-L-метионат.
К смеси иэ 200 мл диметилформамида и 19,9 г (О, 1 моль) хлоргидрата метил-L-метионата, охлажденной до О С, при перемешивании добавляют 19,9 мл (0,1 моль) дициклогексиламина, 26,5 r (0,1 моль) и > — трее-бутилоксикарбонил-L-фенилаланина, 13,5 г (0,1 моль) оксибензотиазола и 20,6 (0,1 моль) дициклогексилкарбодиимида. Полученную смесь перемешивают 2 ч при O C u
24 ч при комнатной температуре, затем вновь охлаждают до О С и образовавшийся осадок отфильтровывают.фильтрат концентрируют в вакууме и остаток растворяют в этилацетате.Раствор промывают последовательно холодной
0,75 N лимонной кислотой, водой, 1 и раствором бикарбоната натрия и водой. Этилацетатный слой сушат над сульфатом магния и упаривают в вакууме до получения кристаллического остатка. Остаток дважды перекристаллизовывают из смеси эфира и петролейного эфира и получают 26,6 г (65Ъ) целевого соединения;т.пл. 8992оС.
Найдено,%: С 58,41; Н 7,15;
М 6,71.
CKH+t06S (410, 53).
Вычислено,%: С 58,51; Н 7, 37;
N 6,82.
Б. Й -mpem-Бутилоксикарбонил-L-фенилаланин-(-метиониламид.
К 60 мл метанола добавляют 13,0 г соединения, полученного в условиях, описанных в части А. Полученную суспензию помещают в толстостенную склянку, снабженную мешалкой. Смесь охлаждают до -78 С и добавляют к ней 60 мл жидкого безводного аммиака.
Реакционный сосуд закрывают и предоставляют содержимому воэможность наг5
65 реться до комнатной температуры,при которой жидкость перемешивают 24 ч.
Затем сосуд снова медленно охлаждают до -78©С и открывают. Остаток аммиака испаряют при нагревании смеси и продукт, полученный после выпаривания метанола, перекристаллизовывают иэ метанола, получают 9,7 r (77Ъ) целевого соединения; т.пл. 192-195 С.
Найдено, Ъ: С 57,41; Н 7,17;
N 10,37.
CggH gN 04 S (395,52).
Вычислено, Ъ: С 5 7, 70; Н 7, 39 ", М 10,62.
В. Хлоргидрат L-фенилаланил-L-метиониламида.
К 150 мл ледяной уксусной кислоты, содержащей 10 мл анизола и 10 мл тризтилсилана, добавляют 9,6 r (0,024 моль) продукта части Б. Затем через смесь пропускали безводный хлористый водород с помощью трубки, диспергирующей газ, и через 30 мин реакционную смесь разбавляют эфиром.
Образовавшийся осадок перекристаллизовывают .из смеси этанола и эфира и получают 7,5 r {94Ъ) целевого соединения; т.пл. 214-216 С.
Найдено,Ъ: С 50,75; Н 6,84;
N 12,54.
С„,Н„М, 0,5СЕ (331,87).
Вычислено Ъ: С 50, б 7; Н 6, 68;
N 12,66.
Г. N -mt>em-Бутилоксикарбонил-0-аланилглицил- L-фенилаланил-L-метион иламид.
К 40 мл диметилформамида добавляют 1,66 r (0,005 моль) продукта, описанного в части В, и дициклогексиламин (0,99 мл, 0,005 моль) и раствор перемешивают при охлаждении до О С. Затем к смеси добавляют
0,88 r (0,005 моль) N -epee-бутилоксикарбонилглицина, 0,68 г (0,005 моль) оксибензотиазола и
1,03 r (О, 005 моль) дициклогексилкарбодиимида. Полученную смесь перемешивают 2 ч при ОоС, а затем 24 ч при комнатной температуре. Осадок, образовавшийся после повторного охлаждения смеси до О С, отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме.
Остаток растворяют в этилацетате и раствор промывают последовательно
1 N раствором бикарбоиата натрия, водой, холодной 0,75 N лимонной кислотой и водой. Органическую фазу сушат над сульфатом магния, фильтруют и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в горячем этилацетате.После охлаждения образуется гель, который не поддается кристаллизации, гель фильтруют, сушат, получают 1,7 г аморфного твердого вещества. Вещество суспендируют в 50 мл ацетонитрила, содержащего 5 мл анизола и
5 мл триэтилсилана. После добавления моногидрата п-толуолсульфокислоты смесь перемешивают 5 ч. Полу"3
14
753358 ченный осадок отфильтровывают, сушат и получают 1,6 r {0,003 моль) сырой соли П-толуолсульфокислоты и глицил-L-фенилаланил-L-метиониламида.
Этот продукт растворяют в 30 мл безводного диметилформамида, охлаждают до О С, добавляют 0,336 r (О, 003 моль) DABCO и через 10 мин
0 8 r (0,004 моль) М .- Реп -бутилQL оксикарбонил-D-аланина, 0,540 r (0,004 моль) оксибензотиазола и0,824 г (0,004 моль) дициклогексилкарбодиимида. Полученную смесь перемешивают 2 ч при О С и 48 ч при комнатной температуре. Вновь охлаждают до О С и фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растворяют в бутаноле и раствор промывают последовательно 1 М раствором бикарбоната натрия, водой, холодной
0,75 N лимонной кислотой и водой.
Органическую фазу сушат над сульфа- 20 том магния, фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в горячем этаноле и при добавлении этилацетата получают в виде осадка целевое соединение (1,1 г 42%).
Анализ аминокислоты: Н айде но РА а
1,01, G%y 1,01; Phe 1,01; Het 0,98.
Д. N -атрее-Бутилоксикарбонил- тирозил -D-аланилглицил-б-фенилаланил— L-метиониламид.
К смеси 20 мл.ледяной уксусной кислоты, 2 мл анизола и 2 мл триэтилсилана добавляют 1,0 г (0,0019 моль) продукта, описанного в части Г. С помощью трубки, диспергирующей газ, в смесь вводят в течение 30 мин безводный хлористый водород. Затем к реакционной смеси добавляют эфир и образовавшийся осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,870 г твердого вещества, кото- 40 рое растворяют в смеси 20 мл холодного (00C) диметилформамида и О, 38 мл (0,0019 моль) дициклогексиламина.
Через 10 мин к смеси добавляют
0,534 r (0,0019 моль) N - ropom— 45
-бутилоксикарбонил-L-тирозина, 0,257 г (0,0019 моль) оксибензотазола и 0,391 r (0,0019 моль) дициклогексилкарбодиимида. Перемешивание продолжают при О С 2 ч и при комнат- 50 ной температуре 24 ч. После повторного охлаждения смеси до О C образовавшийся осадок отфильтровывают и фильтрат концентрируют в вакууме.
Полученный остаток растворяют в бутаноле и раствор промывают последовательно 1 М раствором бикарбоната натрия, водой, холодной 0,75 N лимонной кислотой и водой. Органическую фазу сушат над сульфатом. магния,фильтруют и фильтрат концентрируют в ваку- 60 уме. При попытках кристаллизовать остаток из этилапетата или этанола получают гель. Остаток растворяют в горячем метаноле и раствор наносят на пластинку для хроматографирования Я в тонком слое, для элюирования используют смесь хлороформа и метанола (9:1). Соответствукицую полосу вырезают с пластинки и экстрагируют смесью хлороформа и метанола. После выпаривания растворителя в вакууме получают 0,270 г (21%) целевого соединения; Р = О, 17.
Анализ аминокислоты: Найдено Tyr
1,00, Ма 1,02, GRy 0,99; Phe 1,02;
Het 0,98.
Е. Хлоргидрат L-тироэил-0-аланилглицил- -фенилаланил-L-метиониламида.
К 5 мл ледяной уксусной кислоты, содержащей 0,25 мл анизола, добавляют
0,270 г (0,0004 моль) продукта, описанного в части Д. В смесь вводят с помощью диспергирующей трубки хлористый водород в течение 20 мин.Затем реакционную смесь охлаждают и лиофилизируют, получают 0,182 r (75%) целевого соединения; R" = 0,5.
Анализ аминокислоты: Найдено Tyr
0,99; А9а 1,00; GRy 0,99; Fhe 1,01;
Met 0,91.
Этот анализ показал присутствие сульфоксида метионина.
Пример 4. Приготовление трехводного хлоргидрата -тирозил-0-аланилглицил-М -метил-L-аланил— N -метил-L-метиониламида.
Ф
А. N -ape>-Бутилоксикарбонил-N
tW Ф
-метил-L-фенилалинат-М,N-дициклогексиламмония.
К 80 мл безводного тетрагидрофурана добавляют 5,3 г (О, 02 моль)
М -rnPe áóòèëîêñèêàðáîíèë-1-фенилаланина. Полученный раствор охлаждают примерно до 10 С и добавляют
10 мл безводного диметилформамида и 0,5 r 18-кроун-6-эфира. Затем к полученной смеси медленно добавляют 10,15 r (содержащей 0,060 моль
КН) масляной дисперсии гидрида калия, Полученную смесь охлаждают.до 00С и добавляют к ней 1,24 мп (0,020 моль) йодистого метила. Перемешивание при комнатной температуре продолжают 24 ч. Затем смесь выливают в дробленный лед и экстрагируюх эфиром. Водную фазу подкисляют до рН 2 лимонной кислотой и продукт экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу промывают водой, сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме. Получают некристаллиэирующийся сироп, спектр ЯМР которого соответствует предполагаемому производному.
ЯИР ).СР 2,72, N-СН,; д 1,35, С(CH3)Ъ).
Сироп растворяют в эфире и к раствору добавляют 4 0 мл дициклогексиламина. При охлаждении выпадают кристаллы, из которых после кристаллизации из смеси метанол-сложный эфир получают 6,8 г (74%) целевого соединения т. пл. 171-174 С, P a J -22, О (С 1, метанол).
753358
16.
Найдено,Ъ: С 70,60, Н 9,49; и 6,19.
Суй»»М» О» (460, 66).
Вычислено, Ъ: С 70,40, Н 9,63, и 6,08.
Б. и -трет-ьутилоксикарбонил-N — 5
-метил-L-фенилаланил-N -метил-L-метиониламид.
Смесь из 30 мл безводного диметилформамида, содержащего 1,98 r (0,010 моль) хлористоводородной соли й®-метил-(.-метиониламида и 4,16 r (.0,010 моль) и -ш/ е -бутилоксикарбонил-М"-метил-L-фенилаланина перемешивают 5 мин, затем охлаждают до
О С и добавляют оксибензотаэол
15 (1,35 г, 0,010 моль) и дициклогексилкарбодиимид (2,06 г, 0,010 моль).
Эту смесь перемешивают 2 ч при ÎОC и 24 ч при комнатной температуре, . Выделившийся осадок отфильтровывают и фильтрат концентрируют в вакууме до получения сиропа, который растворяют в этилацетате. Этот раствор промывают последовательно 1N раствором бикарбоната натрия, водой, холодной 0,75 и лимонной кислотой и водой. Органическую фазу сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме,до сиропа. Сироп растворяют в хлороформе, вносят в колонку (3x50 см) с силикагелем и продукт 30 элюируют хлороформом, а затем смесью хлороформа с метанолом (9,75:0,25).
Фракции объединяют и после концентрирования в вакууме получают 1,4 r (ЗЗЪ) сиропа, имевшего спектр ЯМР, 35 соответствующий спектру целевого соединения.
ЯМР: Д 2,93, N-CH Phe",d 2,73;
N-CH>Net ; сР 2,10; S-CH>, б 1,37 с(сн ) 40
В. N +- Pen-Бутилоксикарбонил- L-тирозил-0-аланилглицил-N@-метил- -фенилаланил-Ng-метил-L-метиониламид.
К смеси 5 мл ледяной уксусной кис- 45 лоты„ 1 мл аниэола и 1 мл триэтилсилана добавляют 1,4 г (0,0033 моль) продукта части Б. Через смесь пропускают безводный хлористый водород в течение ЗО мин, затем реакционную смесь разбавляют эфиром. Образовавшийся осадок выделяют и сушат (1,1 г), затем растворяют 40 мл диметилформамида. К охлажденной до ООС реакционной смеси добавляют.1,27 г (0,0031 моль) продукта, получение которого описано в части Д примера 1, 0,420 r (0,0031 моль) оксибенэотиазола и 0,640 г (О, 0031 моль) .дицик-, логексилкарбодиимида. Через 10 мин добавляют 0,43 г (0,0031 моль) три- 60 этиламина и перемешивание продолжа" . ют при О С 2 ч и при 4 С вЂ” 48 ч.Образовавшийся осадок отфильтровывают и фильтрат концентрируют в вакууме до сиропа, который затем растворяют в 65 этилацетате. Раствор последовательно промывают 1 И раствором бикарбоната натрия, водой, холодной 0,75 N лимонной кислотой и водой, а затем сушат над сульфатом магния, фильтруют и фильтрат концентрируют .в вакууме до получения 2,0 r сырого продукта.
Продукт растворяют в хлороформе, раствор вносят в колонку (3x50 см) с силикателем и продукт элюируют хлороформом, а затем смесью хлороформа и метанола (9:1). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, концентрируют в вакууме,, получают 1,,1 r (47Ъ) некристаллического целевого соединения.
Найдено,Ъ: С 59,01; Н 6,78;
N 11,58.
С3рНщф э (714, 88 ), Вычислено,Ъ: С 68,80; Н 7,05, N 11,76 °
Ж. Трехводный хлоргидрат L-тироэил-О-аланилглицил-N -метил-О-фенилаланил-й -метил-L-метиониламида.
К смеси 10 мл ледяной уксусной кислоты и 0,5 мл аниэола добавляют
0,70 г (0,001 моль) продукта, описанного в части В. Через смесь в течение 20 мин пропускают безводный хлористый водород. Затем реакционную смесь охлаждают и лиофилизируют до получения 0,678 г гигроскопического целевого соединения.
Найдено,Ъ: С 51,13; Н 6,.97;
N 11,72.
C p»3Ng0gS CP. ЗН2 О (705, 23) .
Вычйслено, Ъ: С 51, 08; Н 7, О;
М 11,91.
Анализ аминокислот: Найдено Туr
1,03; AQa 1,01; GRy 0,96.
Пример 5. Приготовления моноацетата-1,25-хлоргидрата L-тирозил-D-аланил-L-аланил-L-фенилаланил-N+-метил-L-метиониламида.
А. Бензил-N -mpem -бутилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозил-0-аланил-0-алината.
К раствору 3,19 г (0,010 моль) п-толуолсульфонатной соли бенэилалината в 30 мл безводного диметилформамида добавляют 4,43 r (0,010 моль) продукта., описанного в части Б примера 1. Смесь охлаждают до Î C и добавляют к ней 1,12 r (0,010 молЬ) DABCO, а затем через 10 мин -2,135 r (О, 010 моль ) оксибен эотазола и
2,06 г (0,010 моль) дициклогексилкарбодиимида. Полученную смесь перемешивают 2 ч при О С и 48 ч при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме до сиропа.
Сироп растворяют в этилацетате и раствор промывают последовательно
1 М раствором бикарбоната натрия, водой,-холодной 0,75 М соляной кислотой и водой. Органическую фазу сушат над сульфатом магния, фильтруют.
17
753358
60
Фильтрат концентрируют в вакууме и получают остаток, который не кристаллизуется из этанола или эфира.
При разбавлении эфирного раствора петролейным эфиром получают гель, который фильтруют и сушат в вакууме.
Сырой аморфный продукт (4,0 г) вносят в колонку 3 50 см с силикагелем и продукт элюируют хлороформом,затем смесью хлороформа и метанола (9,75 : 0,25). Объединяют фракции, содержащие целевой продукт,элюат упаривают в вакууме, получают сиропообраэный остаток. Этот остаток растворяют в эфире и при добавлении к раствору петролейного эфира получают 3,0 г (50Ъ) целевого соединения в виде аморфного твердого вещества; т.пл. 100-104 С.
Найдено,Ъ: С 67,56; Н 6,60;
N 7,16.
С34Н,й Îó (603, 72 ) °
Вычислено,Ъ: С 67,64; Н 6,85, и 6,96.
Б. и -врет-Бутилоксикарбонил-L-тирозил-0-аланил-С-аланил.
К 5 мл безводного диметилформамида добавляют 2,9 г (0,0048 моль) продукта, описанного в части A.3a- тем к смеси добавляют 1,0 г 5Ъ-ного палладия на угле и 50 мл этанола.
В течение б ч в смесь вводят водород при атмосферном давлении и комнатной температуре. Затем реакционный сосуд продувают азотом, отфильтровывают катализатор и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и раствор разбавляют эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают и сушат в вакууме, получают 1,5 г (74Ъ) целевого соединения в виде аморфного твердого вещества; (Og> = 25,9 (С = 5, хлороформ).
Найдено,Ъ: С 56,80; Н 9>95;
N 9,81, С енл йэ О у (423, 47), Вычислено, Ъ: С 56,73; Н 6,90;
N 9,92.
В. N -mpem-Бутилоксикарбоиил-L фь
-тирозил-0-аланил-L-аланил-L-фенилаланил-N -метил-L-метиониламид.
Смесь из 10 мл безводного диметилформамида, 0,692 г (0,002 моль) хлористоводородной соли L -фенилаланин-N -метил-L-метиониламида (приготовлен, как описано в части 3 примера 1) охлаждают до ООС и добавляют к ней 0,28 мл (0,002 моль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 10 мин и добавляют к ней
0,846 г (О, 002 моль) продукта, описанного в части Б, затем 0,270 r (0,002 моль) оксибензотиаэола и
0,412 r (0,002 моль) дициклогексилкарбодиимида. Полученную смесь перемешивают 2 ч при ООС и 48 ч при комнатной температуре. После повторного охлаждения до О С смесь фильт5
2Q
50 руют и фильтрат концентрируют в ваку" уме. Остаток растворяют в этилацетате и раствор промывают последовательно 1N раствором бикарбоната натрия, водой, холодной О, 75 и лимонной кислотой и водой. Органичес" кую фазу сушат над сульфатом магния, фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме, получают 1,6 г сырого продукта. Продукт растворяют в хлороформе и помещают на две пластинки для анализа толстослойной хроматографией. Проявление ведут в смеси хлороформ и метанол (9:1). Основные полосы вырезают из каждой пластины и продукт выделяют из силикагеля, экстрагируя смесью хлороформа и метанола. Элюат (1,3 г) растворяют, вновь наносят на одинарную пластинку для толстослойной хроматографии и получают 1,0 г (70Ъ) целевого соединения в виде аморфного твердого вещества; с ) — 25,бо (C = 0,5, метанол).
Найдено, С 58,60; Н 6,87;
N 11,53.
СЗ Н5дй О 85 (714, 88).
Вычислейо,Ъ: С 58,80, Н 7,05;
N 11, 76.
Г. Моноацетат хлоргидрата
-тироэил-0-аланил-L-аланил-L-фенилаланил-N+-метил-L-метиониламида.
Через смесь иэ 5 мл ледяной уксусной кислоты, содержащей 0,5 мл аниэола,и 0,880 г (0,0011 моль) продукта, описанного в части В, барботируют хлористый водород в течение 30 мин, затем реакционную смесь охлаждают и лиофилизируют. Получают
0,704 г целевого соединения; (с, > — 16,2 о (С = 0,5, метанол), Найдено,Ъ: С 53,48; Н 6,47;
N 11,62; CP 6,50.
Сзон )4 06S ° 1,25 НСР -СтН О (719,14)
Вычйслено, Ъ: С 53, 43; Н б, 45;
N 11,68; С 6,16.
Анализ аминокислоты: Найдено Tyr
1,00; А а 1,99; Phe 1, 01.
Пример 6. Приготовление ацетата L-тирозил-0-аланилглицил-L-фенилаланил-С-N -метил-S-этилцист еи нил амид а.
М
A. Дициклогексиламиновая соль
N — nlpem-бутилоксикарбонил-S-этил-L-цистеина.
К 400 мл диметилформамида добавляют 50 г (0,336 моль) L-(S-этил)-цистеина, а затем тетраметилгуанидин (44,8 мл, 0,336 моль) и дициклогексиламин (66,8 мл, 0,336 моль).
После этого по каплям при перемешивании добавляют mpem -бутиловый эфир азидомуравьиной кислоты (68 мл, 0,50 моль). в течение 1 ч и смесь продолжают перемешивать в течение
48 ч при комнатной температуре.
Выпавший в осадок аэид дициклогексиламмония отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток
19
753358
5
d0
Б5 распределяют между эфиром и водой. рН водного слоя повышают до 8,0.
Органический слой отделяют и отбрасывают. Водный слой подкисляют до рН 2,0 холодной разбавленной соляной кислотой и экстрагируют холодным этилацетатом. Этилацетатную фазу промывают водой, сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме.
Полученный остаток растворяют в эфире и к раствору добавляют 66,8 мл (0,336 моль) дициклогексиламина.
Полученный осадок перекристаллизовывают из этилацетата и получают
32,8 r (23Ъ от теории) целевого соединения, т.пл. 156-159 С; (о )
1о (С 1 О „,. анол).,- 25 7 7 (С = 1, метанол).
Найдено,Ъ: С 61,37, Н 9,98 и 6,26.
С gH4gN 04S (430,6) .
Вычислено,%: С 61,36, Н 9,83;
N 6,51.
Б. и -Еутилоксикарбонил-й-ме 0 » тил-S-этил-L-цистеиниламид.
К 50 мл безводного тетрагидрофурана добавляют 18,58 г (74,3 моль) и -бутилоксикарбонил-S-этил-LФ
-цистеина (приготовлен при нейтрализации продукта, описанного в части А. и экстракции этилацетатом).
Полученную смесь по каплям в течение 30 мин добавляют к перемешиваемой суспенэии 42,45 r гидрида калия (22,1Ъ КН в минеральном масле„
0,234 моль КН) в 375 мл тетрагидрофурана при О С и содержащей 0,35 г
18-кроун-6-эфир