Белковая смесь для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях и способ ее получения

Белковая смесь для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях и способ ее получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1, Белковая смесь, содержавшая ..ilift и у г глобулины при следуютем соотношении компонентов, мае.%: ,-глобулин 30-40 ft -глобулин 40-50 f -глобулиц 10-20 для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2735700/23-04 (22) 15.01.79 (46) 07.02.84. Бюл. М 5 (72) A.A.Aõðåì, И.И.Вашкевич, О.В.Свиридов, О.A.Стрельченок и Л.И.Сурвило (71) Институт биоорганической химии AH БССР (53) 547 ° 964.4.07 (088.8) (56) 1.Rosher W., Smith R. "Хво1аИ.

2. Rosner W., Bra,dlov Н.L. "isolation and Purification of CorticostегоidBinding Globulin from Human

Plasma дуаf. fini ty chromatography, Nethods in Enzymology, 1975, 36, с.104.

3. Burton R.Ì., Westphal U. Stегоid Hormone- binding Proteins in

Blood. Plasma, Netabolism, 1972, 21 ° 93к с.253.

„.SUÄÄ .758742 A

3(5И С 07 G 7/00! С 07 G 2/02G

A 61 К 37 02 (54) ..; БЕЛКОВАЯ СМЕСЬ ДЛЯ СВЯзыВАния стеРОидних ГОРМОИОВ В БиолоГИЧЕСКИХ жИДКОСтЯХ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУ=

ЧЕДИЯ (57) 1. Белковая смесь, содержащая +, p и т —, глобулнны при следующем соотношении компонентов, Мас. Ъ: о". -глобулин 30-40

P — глобулин 40-50 т -глобулин 10-20 для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях.

758742

5 (О

2. Способ получения белковой сме си по п. 1, о т л и ч а ю щ и 9 с я тем, что лишенную эндогениых стерои-» дов сыворотку ретроплацентариой крови .человека смешивают с биоспецифическим сорбентом, содержащим конъюгированный кортиэол с концентрацией кортизола в полученной суспензии

5 ° 106- 7 ° 10 моль/л, инкубируют при

2-8 С в течение б-12 ч при перемешивании, сорбент промывают при 2-8 С

Изобретение относится к новой белковой смеси для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях, которая может найти при- менение в медицине и биохимических исследованиях и к способу ее получе. ния.

Известна белковая смесь, содержащая р -глобулин (1).

Этот белок связывает андрогены и зстрогены в мольном соотношении белок: стероид 1:1 с очень высокими константами ассоциации : 10 М (специфически связывающий белок). Кроме ф-глобулина в состав смеси входят альбумин и другие белки, Альбумин связывает андрогены, экстрогены, кортикостероиды и прогестины в мольном соотношении белок: стероид 1г ъ(п о 1) с низкой константой ассоциации; 10 — 10 М " (неспецифически связывающий белок) . Количественное содержание компонентов белковой смеси не приводится.

Недостатком этой смеси является то, что хотя такая белковая смесь потенциально может быть применена для анализа андрогенов и экстрогенов, однако она не обладает специфической связывающей способностью по отношению к кортикостероидам и прогестинам и не может быть использована для их количественного определения. Кроме того, присутствие альбумина в известной смеси снижает специфичность и.чувствительность анализа андрогенов и эстрогенов.

Такую белковую смесь получают путем обработки сыворотки нормальной крови человека последовательно этиловым спиртом и сульфатом аммония> полученную при этом белковую фракцию, лишенную эндогенных стероидов, перемешивают С биоспецифнческим сорбентом в течение 2 ч при 4 С. В каО честве биоспецифического сорбента применяют продукт последовательного присоединения азодианилина и 3-гемисукцината андростандиола к акти,солевым раствором и элюируют при

30-40 С компоненты белковой смеси

O раствором кортизола в трио-НС1 буфере, содержащем ионы кальция.

3. Способ по п. 2, от ли чаюшийся тем, что в качестве био,специфического сорбента используют продукт последовательного присоединения 1,б-диаминогексана и 21-ге>а»сукцината кортиэола к активированной эпихлоргидрином агарозе. вированной эпихлоргидрином сефаро-" зе 4 В.

Смесь переносят в колонк и отмывают от балластных белков 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 7, 5, 1 И по

NaC1 при 4ОС. Биоспецифически адсорбированные белки элюируют при о

4 С после гидролиза азосвязи дитионитом натрия в 0,3 М трис-НС1 буфере, рН 7,0, содержащем дигидротестостерон . Для стабили з ации р -глобулина во все промывающие и элюирующие буФеры вводят ионы Са +.

Известна белковая смесь (2), обогащенная о „-глобулином, специфйчески связывающим кортикостероидные гормоны и составляющим 20-50% от общего содержания белка. Другие белки смеси охарактеризованы как у -глобулины и альбумин.

Недостаток этой белковой смеси состоит в том, что хотя такая белко- вая смесь потенциально может быть применена для анализа кортикостероидов и прогестинов, однако она не обладает связывыощей способностью по отношению к андрогенам и эстро-генам и не может быть использована для их количественного определения.

Присутствующий в этой смеси альбу30 мин снижает специфичность и чувствительность анализа прогестинов, Способ получения такой белковой смеси состоит в том, что сыворотку нормальной крови доноров, лишенную эндогенных стероидов, перемешивают с биоспецифическим сорбентом в течение 1,5 ч при 4 С. Сорбент представляет собой продукт последовательно(ro присоединения 3,3-диаминодипропиламина и 21-гемисукцината кОртизола к активированной бромцианом сефарозе 4В. Смесь переносят в колонку и отмывают от балластных белков при

4 С сначала 0,05 N натрийфосфатным

0 буФером, рН 7,0, О, 2 М по NaC1, затем 0,001 Я натрийфосфатным буфером, рН 7,0. Биоспецифически адсорбированные белки элюируют при 25 С раствором кортиэола (200 мкг/мл) н 0 „. 05 M натрийфосфатном буфере, рН 6,5, 0,1 M по NaC1.

Известные способы выделения белконых смесей, связывающих стероидные гормоны, позволяют получить бел. ковые смеси, содержащие или только сС„- или только р -глобулины, обладающие специфическим связыванием.

Кроме того, способы предусматривают ,две раздельные процедуры синтеза аффинных сорбент -z, включают дне

ПОСЛЕДОВаТЕЛЬНОСть НЕОДИНаКОНЫХ Oiie» раций, проводимых раздельно и требующих поэтому вдвое больших затрат сыворотки и реактивов. Таким образом, очевидна неэкономичность IIромышленного освоения известны>: cI;о собон получения белкогых смесей д;-.я

14 * целей клинического анализ-". кор-Irêо= стероидов, прогестинов, анцр ":. . :;Он и эстрогенов.

Цель изобретения - ел.-<оза"" -.:iIec-,= нового состава,связывающая к.:; тнкоСТЕРОИДЫ,ПРОГЕСТИНЫ,аидРОГЕ;iLr Н 3 трогены, и способ ее получены:-»., Предлагается белковая cr,, añü держащая а .„-, ). и г — гло ул-инû,—,; при следующем соотношении Iro IICI- а: —::— тон, вес.Ъ:

Ы „-глобулин 30-40 — глобулин 40-50 у -глобулин 10-20

Предлагается также дпя сняв.=..нанни стероидных гормонов н биолоr;=!eских жидкостях способ получения такой белковой cwecI,. заключающийcH L что лишенную эндогенных стероидов сыворотку ретроплапентарной кровы человека смешивают с биоспецифичес-, ким сорбентом, содержащим кс;.нъюгиронанный кортизол с концентрацией кортизола в полученной сусгенэии 5 10 7 10 моль/л,инкубируют при 2-К.

8 оС в течение б-12 ч при перемешина, нии,сорбент промывают при 2-8оС со» левым раствором и элюируют при 3040оС компоненты белковой смеси раст- вором корткэола н тряс-НС1 6ycbepe содержащем ионы кальция.

Пример 1. Получение белковой с-мес".и. Перед стадией аффинной хрома":. графин иэ сыворотки ретроплацент.-pHoA крови удаляот эндогенные сте5 роиды, Затем к 5 л лишенной зндогенн..-.х стероидов сыворотки прибавляют

00 мл геля соу ен,a, содержащего

1 мкмоль KoHъюгирананного кортиэола на 1 мл уплоЪненнаro геля, что создает концентрацию кортиэсла во всем объеме суспензия 2-10 о моль/л„ Гы -.:ченную с.успензию перемешивают прн 4 С н =:å÷åíèå 8 ч. Лффинный сор бент Отделяют путем фильтрования ,-.- спензии на пористом стеклянном

Фильтре и промывают 1 л охлажденного до 4 С 0,05 И трис-НС1 буфера рН 8,0, 0„5 М .o NaC1 и 0,05 М по

СаС1 „ (стандартный буфер) . Гель переносят н колонку с пористым стек5G лянным оильтро...-;::: продолжают отмыво ку от баллас.тны -: белков при 4 C

О, 5 л того ке буфера, Затем через колонку пропуcê doT при 4 С 70 мп стандартного:.=, у -=ря, содержащего

55 00 лкг/мл кортнзола (для полного р»аст орен :.- с-:. =-",.амида н буфер доб авля;-от:% метанола) . Для десорбции белков темпера=-уру колонки повышают до 37 "С и ныдержнныот н этом режиме

Щ в те ение 1 ч. Белки элюнруют 70 мл ,. стандартного буфера, содержащего кор. тизол. Общее количество белка н эпюа. те состанляет 280 мг. Увеличение объема сыворотки вплсть да 9 л при65 водит к увеличению выхода 6Елковой

» прЕДПОЧТИТЗЛЬНЫМ НсЦЗИаН ТОМ СПОСО ба является применение н ка -.естне биоспецифнческогс сорбента продух а . последовател -ного присоединения

1,б-ди=-.миногексана и 21-гемисукцината корти эола и акт инирон анной эш:" хлоргицэино".4 сахарОзe

Белковая с.месь может быть полувнна или н ниде водного раствора (концентрация белка A<40 ????>

Выбор источника сырья для выделения 6."=пконой смеси обусловлен, во первых, доступностью и низкой стоимостью ретроплацентарной крови по .сравнению с нормальной кровью доноров но-»перных, тем, что ретропла: центарная кронь содержит значительно большее количество стероицснязынающих о(„-глобулина и р -глобулина (3j по сравнению с нормальной кро5 вью. укаэанные выше концентрации конъюгиронанного кортизола на матрице и соотношение объемов аффинного сорбента и сыворотки подбираются эмпиI() ри"ески с целью избирательной адсорб" ции стероидс;н;-.зывэющих а„ вЂ” I; p -глобуяинон. Более продолжитс-чьное по сравнению с а».rëoÃII÷íí "û способами

IIer:емешинаьие сыворотки с сорбентом —.Озноляет исключить адсорбцию альбук;. а на аффинной матрице. Фосфатный буфep: три =-HC1 буфер с здержащий

"а,- ран;-озффектинны при промьнке балластных белков . TpHc»

Н .- -- =:уфер, содержащий Са, стабилиэир. -ет стероидсн язын ающие свойства .,-глобулина н процессе выделения и . .:зн последующем хранении белковой смес::, Применяемые н предлагаемом с:пасoáe условия элюции биоспецифи ески адсорбиронанных на кортизолсефарозе белков (темпeparypa,концентрация кортизола н буфере) обеспечивают полную десорбцию компонентов предлагаемой белковой смеси, 758742 смеси до 350 мг. При перемешивании суспенэии в течение б ч выход белковой смеси равен 220 мг, а в течение

12 ч — 310 мг. Замена стандартного буфера на 0,05 М натрийфосфатный буФер, рН 8,0, снижает выход до

260 мг. При концентрации конъюгированного кортиэола 0,5 мкмоль на 1 мп уплотненного геля биоспецифического сорбента получают 190 мг белковой смеси, 2,0 мкмоль — 290 мг.

Пример 2. Качественный и количественный состав белковой смеси.

Качественный состав белковой смеси определяют с помсщью электрофореза в 7, 5%-ном полиакриламидном геле, измеряя относительные электрофоретические подвижности(Я ) компонентов

:смеси. Получение величины сравнивают с эталонными значениями Р и относят компоненты смеси к определенным классам белков. Количественный состав белковой смеси определяют посредством элюции из геля компонентов смеси, разделенных электрофоретически, и проведения количественного анализа белков. Электрофорез проводят после нанесения 200 мкг белко-

Количественный состав предлагаемой белковой смеси приведен в табл.l.

Эта таблица содержит данные по количественному определению компонентов белковой смеси, полученной в результате 8 независимых выделений. Содержание каждого компонента выражено в мас.% от их суммарного количества.

Выделение: 1-белковую смесь получают, как в примере 1, ХŠ— объем сыворотки 3 л; ХХХ вЂ” объем сыворотки

9 л; lу — перемешивание суспензии длится 6 ч; Ч вЂ” перемешивание суспензии длится 12 ч; Уl — концентрация конъюгированного кортизола, 0,5 мкмоль/мл уплотненного геля;

УП вЂ” концентрация конъюгированного кортизола 2,0 мкмоль/мл; УШ вЂ” стандартный буфер заменяют 0,05 М натрийфосфатный буфер, рН 8,0.

60 вой смеси, выделенной в соответствии с примером 1, на каждую трубочку

:геля. Белковые эоны одной из трубочек окрашивают и проводят качественное определение компонентов белковой смеси. Соответствующие эоны другой неокрашенной трубочки вырезают и элюируют белки трис-НС1 буфером.

Затем в элюатах проводят количественное определение белка. Качественный состав предлагаемой белковой смеси приведен на чертеже. Хорошо разделенные компоненты смеси имеют R

0,614;0,401;0,293 и относятся к 40 т -глобулинам соответственно. Как видно из чертежа, на электрофореграмме отсутствует компонент с подвижностью, соответствующей альбуми; ну человека(эталонное значение R 0,714 ).)5

Пример 3. Связывание стероидных гормонов белковой смесью. Стероидсвяэывающие свойства предлагаемой белковой смеси выявляют методами электрофореэа в полиакриламидном геле и равновесного диалиэа белковой смеси в присутствии стероидных гормонов.

A. Электрофорез в полиакриламидном геле. Электрофорез в полиакриламидном геле надежно разделяет свободный и связанный с белком стероиды вследствие того, что электронейтральный свободный стероид остается на старте, а связанный отероид переносится с белком. После проведения электрофореза связанный стероид.локализуется на участке геля, соответствующем полосе белка-носителя. Из раствора белковой смеси полностью удаляют кортизол, внесенный в процессе ее выделения. Для этого используют твердофазную адсорбцию стероида при 37 С в течение

30 мин на 2%-ной суспензии декстранпокрытого активированногo угля. Белковую смесь, лишенную стероида, делят на б проб по 100 мкг, В пробы вносят и уравновешивают (30 мин, 25ОС) радиоактивные и холодные стероиды-тестостерон.(Т) и кортиэол (F). Весовым вкладом радиоактивных (1,2- Hl-кортизола (Р") и (1,2-ЭН) тестостерона (Т+) пренебрегают. Проба 1 содержит только F";.II — F++

О, д мкг F; III — Г++ 0,5 мкг Т;

lу — Т ; У вЂ” Т + 0,5 мкг Т; Уl - T +

0,5 мкг P. Количество радиоактивности, внесенное во все пробы, одинако-, во.

Электрофореэ проводят, как в примере 2/ но при 40С для уменьшения диссоциации комплекса белок-стероид.

После электрофореэа трубочки геля разрезают на участки длиной 2 мм, измеряют их радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике и соотносят с окрашенныьы белковыми зонами на неразрезанных трубочках. Результаты электрофореза системы белковая смесь — стероид отражены на графиках, изображенных на чертеже. Номер кривой на графиках соответствует номеру пробы белковой смеси, содержащей определенную (см. выше) комбинацию стероидов. Из графических построений видно, что следовые количества ксртизола (кривая 1) связываются только с о „ -глобулином, а следовые ко"ичества тестостерона (кривая 1У) связываются только с

$-глобулином. При больших количествах F и Т в пробах (li, У) наблюдается значительное уменьшение связанной радиоактивности и, следовательно, уменьшение процента связанного стероида. Этот факт характеризует

758742

45

4,- и ф -глобулины как специфически связывающие белки. Большие коли чества Т практически не влияют на уровень связанной радиоактивности ,Р (XZX) . В свою очередь, большие количества F мало влияют на уровень связанной радиоактивности Т (У1) .

Хотя электрофоретический анализ дает лишь полуколичественную характеристику стероидсвязывающих свойств .предлагаемой белковой смеси, тем не менее он наглядно демонстрирует

) стероидсвязывающую автономность с(- и р -глобулинов пО отношению к кортизолу и тестостерону и специфичность связывания этих гормонов.

Б»Равновесный диализ. Система белковая смесь-стероид при равновесном диалиэе приходит в состояние термодинамического равновесия.

Присутствие радиоактивного стероида в системе дает возможность определять, отношение концентраций связанного (8) и несвязанного (0) белкокой смесью стероидов. Величина 8/О пропорциональна константе ассоциации комплекса стероид - белок и является критерием количественной оценки связывания различных стероидов с белковой смесью.

Из раствора белковой смеси удаляют кортиэол, внесенный в процессе выделения (cM. пример 3 A) .

Раствор белковой смеси (100 мкг/ мл) делят íà 15 проб по l мл и переносят в отдельные диализные мешочки (внутренний раствор диализной система) ° Мешочек помещают в сосуд с 12 мл стандартного буфера (внешнйй раствор), содержащего радиоактивный и холодный стероиды в следующих комбинациях. Внешний раствор диализной системы 1 содержит радиоактивный кортизол (Г"); ll радиоактивный тестостерон (Т+);

111 — F""+ 0,25 мкг кортизола; lу — .

Т + 0,25 мкг тестостерона У вЂ” F +

0,25 мкг тестостерона: Уl — Т++

0,25 мкг кортизола; У11 - Р++

0,25 мкг кортикостерона) УШ - F" +

0 25 мкг п-дезоксикортизола; 1Х

F + 0,25 мкг и-дезоксикортикостерона; Х - F + 0,25 MKz кортизонау Xl

F++ 0,25 мкг альдостерона; Xll - F +

0,25 мкг прогестерона; ХШ вЂ” Р"+

0,25 мкг 17К-оксипрогестерона; Х1УТ + 0,25 кг дигидротестостерона, ХУ вЂ” Т + 0,25 мкг эстрадиола.

Внешние растворы диализных систем перемешивают при 4 С в течение 48 ч.

О

Затем отбирают по 0,5 мл внутреннего и внешнего раствора, измеряют радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике и рассчитывают величину В/U, Результаты равновесного диалиэа систем белковая. смесь-стеронд: в диа лиэных системах 1-ХУ BtU составляет

МГ6; 314; 166у 156; 372; 296; 15с4 14eOI 15 ° 11 25ю 41 23ю 6 г 18к2 j,20,6а 11,2 16,3 соответственно.

Как видно из приведенных данных в диализных системах УП-ХШ величина

8/О радиоактивного кортнэола значительно ииже, чем в системе 1, не содержащей холодного стероида.

Таким образом, стероидные гормоны в системах УП-ХШ, как и холодный

10 кортизол (9), обладают способностью замЬщать радиоактивный кортизол в его комплексе с белковой смесью.

Поскольку радиоактивный кортиэол связан в белковой смеси с с4-глобулином, то стероиды УП-ХШ также связываются с этим белком и константа связывания стероида тем больше, чем сильнее он понижает В/U. На основании приведенных данных для кортикосте70 роидов и прогестинов можно составить следующую последовательность возрастания их сродства к белковой смеси; кортизон (Х) С альдостерон (Xl) с 17-оксипрогестерон (Xtd) с про75 гестерон (ХП) <кортиэол (III) с нортикостерон (УП) с и-дезоксикортикостерон (1Х) < и-дезоксикортизол (УШ) .

Стероидные гормоны в системах

Хlу и ХУ, как и холодный тестостерон, обладают способностью замещать радиоактивный тестостерон в его комплексах с белковой смесью.

Поскольку радиоактивный тестостерон связан в белковой смеси с р-глобулином (см. пример 3A), то стероиды

Хlу и ХУ также связываются с этим белком. Последовательность возрастания сродства андрогенов и экстрогенов к белковой смеси выглядит так: эстрадиол (ХУ) с тестостерон (1У)с

40 дигидротестостерон (Хlу) . Холодный тестостерон практически не конкурирует с рздиоактивным кортизолом за связывание с белковой смесью (система У) . Из этого следует, что кортикостероиды или прогестины способны связываться с белковой смесью, которая уже содер".жит связанные андрогены и/или эстрогены. Холодный кортизол практически не конкурирует с радиоактивным тестостероном за связывание с белковой смесью (система Уl) . Следовательно, антрогены или эстрогены спо" собны связываться с белковой смесью, которая уже содержит связанные кортикостероиды н/или прогестины.

Природные белковые смеси (например, сыворотка крови), в которых совместно присутствуют стероидсвязывающие o(, и р -глобулины, не обладают

1 способностью специфически и автономно связывать стероидные гормоны, подобно предлагаемой белковой смеси.

Это обусловлено большой разницей в количествах о(,„- и 8 -глобулинов в природной сме"и и присутствии альбу- мина.

В. Стабилизирующее действие у— глобулина на стероидсвяэывающие а2;" и Р -глобулины.

О стабилизирующем действии у— глобулина судят иэ сравнения стеро= идсвяэывающих свойств предлагаемой белковой смеси и свойств компонентов смеси после злектрофоретического отделения у -глобулина. С этой целью проводят электрофорез двух одинаковых проб по 100 мкг белковой смеси н двух трубочках полиакрила2ыдного геля (см. пример .ЗА) . Компоненты смеси злюируют в одной из трубочек 5 совместно (контрольная проба), а в другой трубочке раздельно, получая

Фракцию с „ — и р -глобулинов (опытная проба) и Фракцию у -глобулина.

Из опытной и контрольной проб удаля- 20 ют связанный кортиэол в соответствии с примером ЗА. Затем проводят сравнительное изучение воздействия неко-торых внешних факторов на сняэынающие свойства с,2 в и р -глобулинон э присутствии (контроль) и отсутствии (опыт) у -глобулина. Методом изучения служит равновесный диализ проб в присутствии стероида. Используют диализные системы Ш и lY, пример ЗБ. Результаты эксперимента приведены в табл. 2. Стандартными условиями были условия равновесного дналиэа н примере ЗБ. Температурные воздействия продолжались 15 мин, а затем пробы Охлаждались до 4 С.

Из табл,"- видно, что при Обычно применяемых в работе со стероидсэяэыэающими белками воздействия Отношение 62() для связывания как тестостерона, так и кортизола уменьша- 40 ется более существенно н случае огсутстэия т--глобулина н белковой смеси (опытная проба). При неизменной константе ассоциации уменьшение 8(О отражает уменьшение ксличестна с".е- 4 « роидсвязывающих центров смеси, Сни-жение количества связывающих цент-ров можно объяснить или умень .:е-. нием числа стероидсэязыэающих кОмпо. кентон в пробе -=.- cчет уцалэни.я

f. Г«2обулина, Н2пи . асти ч«н Ой ина кти э аЦией смеси беэ — ГлОбулин и, Иэ ) с зультатов равновесного диализн, фракЦИИ < ССДЕРжаЩЕй ТОЛЬКO у. ГЛО = УЛ«- I след ет ««ТО ot= практи«тески не;ъбла ает стероиДсэЯзываю2 ей: пссО6НОстьЯ (Б/(.2 Для ко« ти оча 0 2 тр ""oi,"тt« o . на 0 03) . Аналогичные данные получены при злектрофореэе (см«пример

ЗА), Таким образом, 2- =глобулин стабилизирует стероидсняэываюшие компоненты предлагаемой белковой смеси.

Основное преимущество предлагаемой белконой смеси заключается н той, что она обладает высокой стерондсвяэывающей емкостью и соцержиz толь. ко полезные компоненты с точки зрения сняэынания стероидных гормонов: е4 — и р -глобулины специфически и

1 автономно свяэынают стероиды различных классОВ 2 B I) - Глобулнн стабили эирует стероидсняэывающую активность смеси. Каждан иэ двух известных белковых смесей содержит только один полезный стероидснязывающий компонент наряду с балластными к неспецифически связывающими белками.

Преимущества предлагаемой белковой смеси обеспечивают ей гораздо более широкое практическое применение по сравнению с аналогами. Предлагаемая смесь может применяться как универсальная и высокочувствительная стероидснязынающая система в конкурентном белково-связывающем анализе стероидных гормонов. Высокая связывающая емкость белковой смеси гозноляет применять ее для эффективного извлечения и концентрирования стероидов из растворов биохимических граизнодстэ и биологических жидкостей.

Предл«знаемый способ полуЧения белковой смеси предусматривает мини-маЛьное число операций, которые обес. печинают совместное выделение M-„— и "g — ГлобулинОэ и стабилиэирующеГО их

Г -глобулича. Эмпирически найденные оптимальные параметры: соотношение

Объемоэ сыэороткч крови и аэфинного сорбента и концентрация конъюнгиро=-анного кортиэола на матрице Определяют избирательную ад-:op6;„-.èþ «råроидснязыэающих компонентов ==-: ==-. =- сокий выход cM:"си. Более продолжительное по равнению с а.налОгами перемешиэ-ние сыворотки с сорбентом

ПОЭНОЛЯЕТ ИСКЛЮЧИть адсарбцию альбумина на биоспециФической матоице

ПрименЯемые и предлагае -=;Ом спОсоб"=услония элюЦии биоспецнфически ад— сорбиронанных бенк08 (температура« конценrоация коотнзола и со; тан бу= фере) o :=- — печивают полную десор,.«цию

:- ОМЦОНЕНТОЭ СМЕСН. низкая стОимост л и дО«-т „- пн ость сырья

0О 8C i1 G B B 8. . - :", MO«Н О .,т Ь ПГЧ 2;,:. - 2. BHного освоения так:" : "-::;.. 6-..

758742

Та блица

Номер выдеКоличественный состав белковой смеси, мкг (мас.Ф) ления а -глобулин

1 р -глобулин ф -глобулин (35) 64 (50) 27 (15) (50) 39. (20) (45) 27 (15) (50) 24 (1.3) (47) 29 (15) (50) .29 (17) (50) 18 (10) (40) 36 (20) (30) 58 (40) 72

92 (37) 69

1У (38) 91

86 (33) 57

90 (40) 72

УП Таблица 2 -глобулина

Стабилизирующее влияние

Значения величины В/U

Опыт

Тестостерон

Кортизол Тестосте. рон

Стаидарные условия

18,2

16,4

17 1

15,6

Температура, Ñ

12,8

14,3

17,6

16,0

4,4

12,6

10,4

7,2

2,2

0,3

0,9

Хранение в стандартных условиях в течение

14,0

13,0

18,0

16,8

3 суток

1 недели

1 месяца

8,0

12,9

13,4

16,6.7,2 1,4

7,0

14 0

Тирам 381 Подписное

ВНИИПИ Заказ 1093/4 филиал ППП "Патент, г.ужгород, ул. Проектная, 4