Штамм 62-продуцент тирозинфеноллиазы

Штамм 62-продуцент тирозинфеноллиазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскмк

С оцмалмстмческмк

Республик (ii) 763462

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 1 30 378 (21) 2604018/28-1 3 с присоединением заявки 1 (о (23) Приоритет

Опубликовано 150980,Б(оллетень ¹ 34

Дата опубликования описания 150980 (51)М. Кл.З

С 12 В 13/10

Государственный комитет

СССР оо делам изобретений и открытий (53) УДК576. 8. 09 3,1 (088.8) (72) Авторы изобретения

N E ÊÓïëåòcêàÿ, Е.Н.Кондратьева и H.C,егоpoB

Московский ордена Ленина к ордена Трудового Красного

Знамени государственный университет им. М. В .Ломоносова (71) Заявитель (54) ШТАММ СITROBACTER FREUNDII 62 — ПРОДУЦЕНТ ТИРОЗИНФЕНОЛЛИАЗЫ

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения бактериальных ферментов.

Извес тен штамм Citrobacter f reundii ATCC 6750-продуцент тирозинфеноллиаэы, характеризующийся рядом культурно-морфологических и физиологобиохимических признаков (1).

Однако известный штамм обладает низкой активностью тирозинфеноллиаэы. Выход тироэина составляет 52 г/л за 42 ч.

Целью изобретения является получение штамма, обладающего высокой 15 активностью тироэинфеноллиаэы.

Штамм Citrobacter freundii 62 получен из ила Московской области.

Штамм Citrobacter freundii 62 хранится в коллекции культур микро- 20 организмов Московского государс твенного университета им,М,B,Ëoìoíoñoâà под номером 62.

Культурально-морфологические признаки. 25

Мелкая грамотрицательная палочка размером на фиксированных окрашенных препаратах 0,4-0,5xl-2 мкм, подвижная, с перитрихиальным жгутикованием. Спор не образует, 30

Мясо-пептонный агар. Грязно-белые блестящие плоские крупные колонии.

Среда с .муравьинокислым кальцием и пептоном образуют твердую пленку мела.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб, Усваивает лимонную кислоту.

Индол не образует, Сероводород образует.

Проба с метилрот положительная.

Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная.

Усваивает с образованием кислоты и газа арабиноэу, галактозу, глюкозу, ксилоэу, лактозу, мальтозу, глицерин, Не сбраживает сахароэу, декстрин, дульцит, иноэит.

Продуцирует тироэинфеноллиазу.

Пример 1.Citrobacter freundii б2 поддерживают в пробирках на жидкой раде, образованной из муравьинокислого кальция 2% и пептона 0,5% на.водопроводной воде, рН 6,8-7,0. Отсюда несколько капель переносят в пробирки со скошенным мясо-пептонным агаром., Выращивают при 30 С, затем

76346 2 пробирки со скошенным содержащей, В:

1,0, 0 1

0 1 пересевают в агаром среды, Пептон

NaC I

KC I

Дрожже— вой авто-лиэат

0,5 (сухого ве щества)

Тирозин 0,02

Агар 1,5

Вода Ос тельное. рн 6,6-6, В °

Выращивают 2 сут. при 30 С, затеМ смывают бактериальный напет стериль ной в одой и в зв ес ь используют в качестве посевного материала из расчета: смыв с одной пробирки на 5-6 колб, каждая со 100 мл среды следующего состава, Ъ:

Бульон Хоттингера

50 мл на 100 мл с реды

Дрожжев ой автолизат

1,0 (cyxoro вещества)

Пептон 0,5

Тироэин 0,2

Пиридоксин 0,01

Вода Ос тальное.

Культивируют на к ачалке при 200 об/мин в течение 23 ч. Клетки со

100 мл среды отделяют центрифугированием и вносят в 50 мл субстрата следующего состава, Ъ:

Фенол 1,0

Пирув ат натрия 4,0

Ацетат аммония 5,0

Эдта 0,1

Дис тиллированная вода 0с тал ьное рН 8,0 устанавливается аммиаком.

Смесь выдерживают на качалке при

200 об/мин и температуре 30 С. Периодически дополнительно вносят фенол, по 0,25 г на 50 мл субстрата через 1,5 ч-всего 7 раз. Общее количество внесенного фенола - 45 r на

1 л субстрата. 3а 7 ч инкубации вносят по 1 г пирувата натрия на 50 мл субстрата. Через 12 ч инкубации получают тироэин в количестве 75,0 г на 1 л субстрата.

Пример Z.Citrobacter treundii

62 выращивают и ставят реакционную смесь по примеру 1. Дополнительно вносят фенол восьмой . раз на

1 2-ый час инк убации . Общее к оличество фенола 50 r на 1 л субстрата. Через 24 ч от начала инКубации получают тирозин в количестве 86,5 r на 1 л субстРата.

Пример З.Citrobacter freundii

62 выращивают по примеру 1.Êëåòêè с

60 мл среды отделяют центрифугирова2,2

Формула изобретения

40 а)там4 Citrobacter freundii 62

-продуцент тирозинфеноллиаэы.

Хранится в коллекции культур микроорганизмов Московского государственного университета им.М,В.Ломоносо65 ва под номером 62.

ЗО

40 вием и вносят в 20 мл субстрата,содержащего, %:

Пирокатехин 4,0

Борная кислота

Пируват натрия 3i0

Ацетат аммония 3 0

1 . NaZS0> 0,2

ЭДТА 0,1

Дис тиллированная вода Ocтальное рН 8, 0 ДОВОДЯТ аМмиаком.

Смесь выдерживают на качалке при

17-19 С . ЧерЕз 21 ч инкубации получают ДОФА в количестве 23,5 r на

1 л субстрата, .Пример 4. Посевной материал

Citrobacter freundii 6 2 подготавливают по примеру 1; Смывают бактерии с пробирки скошенного arapa и засевают среду, содержащую,%:

Автолизат

БВК 3,0

К Н Р04 5 Н д О 0 3

ИаНдР04 0,1

МЯБ04 ° 7 Нго 0 1

Ге804.7 Н О 0,001

Тироэ ин 0,2

Пиридоксин 0,01

Водопроводная вода Остальное рН 6 „6-6,7

Культивируют в конических колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалке с 200 об/мин при 30 С 23 ч. Клетки с. 50 мл среды отделяют центрифугированием и вносят в 50 мл субстрата для синтеза тирозина (по примеру 1), Через 2 ч инкубации на качал ке при 30 С получают тироэ и на

18, 1 г/л.При дополнительном внесении фенола по О, 25 r на 50 мл субстрата на второй и третий час инкубации (общее количество внесенного фенола 20 г/л) через 6 ч от начала инкубации получают тирозина 38,0 г/л.

При выдерживании клеток в субстрате для синтеза ДОФА (no примеру 4) получают через 22 ч инкубации ДОФА

20 0 г/л.

Использование изобретения позволяет получить высокоактивную тироэинФен плиазу в более короткие сроки (ВЫХОД жрОЗИНа составляет 85-86 г/л эа 24 ч).

763462

Сос тавитель Е, Дубовицк ая

Редактор Л.Емельянова Техред И.Асталош

Корректур Г. Решетник

Зак as 6234/25 Тираж 522

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подпис н ое

Филиал ППП Патент, г,ужгород, ул.Проектная, 4

Культурально-морфологические признаки.

Мелкая грамотрицательная палочка размерам на фиксированных окрашенных препаратах 0,4-0,5х1-2 мкм, подвижная, с перитрихиальным жгутикованием. Спор не образует.

Мясо-пептонный агар. Грязно-белые блестящие плоские крупные колонии;

Среда с муравьинокислым кальцием и пептоном. Образует твердую пленку мела .

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб.

Усваивает лимонную кислоту. ю

Индол не образует °

Сероводород об разует.

Проба с метилрот положительная, Реакция Фогес-Проскауэра <отрицательная.

Усваивает с образованием кислоты и газа арабинозу, галактозу, глюкозу, ксилозу, лактозу, мальтозу, глицерин.

Не сбраживает сахароэу, декстрин, дульцит, инозит.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 9 3791924, кл. 195-29, 1974.