Способ получения над-зависимой алкогольдегидрогеназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<>763464 (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 070678 (21) 2626246/28-13 с присоединением заявни ¹â€” (23) Приоритет

Опубликовано 150980. Бюллетень Ко 34

Дата опубликования описания 150980 (5!)М. Кл.

С 12 D 13/10

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (53) УДК577.15.07 (088 ° 8) A. M. Егоров, Т. В .Авилова, Л.С . Платоненкова, О. A,Åãîðîâà, В.В.Карз анов, Н. С, Егоров и И. В. Березин (72) Авторы изобретения

Московский ордена Ленина и ордена Трудового

Красного Знамени госуиарстаенниа униаерситет им.N.В,Ломоносова аа; (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАД-ЭАВИСИМОЙ

АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Изобретение относится к микробно логической промышленности, а именно, к способам получения НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей. 5

Изобретение может найти прнменение в фармацевтической и медицинской промышленности, а также в научных исследованиях.

В последние годы было показано, что НАД-зависимая алкогольдегидрогенаэа из печени человека, лошади и пекарских дрожжей обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует наряду с окислением этанола и окисление метанола.

Способна окислять метанол и НАДзависимая дегидрогеназа иэ метанолокисляющих дрожжей (1).

Однако активность по метанолу НАДзависимой алкогольдегидрогеназы иэ названных источников очень низка.

Получение НАД-зависимой алкогольдегидрогенаэы с высокой активностью по метанолу имеет, кроме чисто науч- 25 ного, также практическое значение.

Окисление метанола с помощью НАД-зависимой алкогольдегидрогенаэы может найти применение в процессах, в которых необходима регенерация кофак- 3() 2 с тора, а именно НАДН. Это многие биохимические окислительные процессы, например получение аминокислот, модификация стероидов и т.д. Перспективным является также создание биоэлектрохииических систем окисления различных органических соединений для создания топливных элементов, в которых НАДН выполнял бы роль переносчика электронов с органических соединений на электрод.

Наиболее близким к изобретению является способ получения НАД-зави- симой алкогольдегидрогеназы иэ дрожжей Pichia pinas предусматривающий культивирование дрожжей при аэрации в периодическом режиме на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные ссли и 2В метилового спирта в качестве источника углерода, а также выделение,фермента (21, Недостатки способаг низкая активность фермента по отношению к метанолу, составляющая 402 нмоль/мг белка.мин> периодические условия культивирования, которые не позволяют поддерживать культуру в одном и том же физиологическом состоянии с высо763464 кой ферментативной активностью; применение в качестве источника углерода метилового спирта усложняет культивирование в промышленных масштабах, так как он летуч и токсичен. В этом случае необходима очистка сточных вод от метанола, 5

Цель изобретения — повышение. метанолокисляющей активности фермента и эффективности процесса.

Ук аз анная цель достигае тся тем, что в качестве продуцента используют дрожжи Candida methylica ИБФМ У-670, а культивирование ведут в проточных условиях, при этом в качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,01-0,1 об,%, 15 . Повышение эффективности процесса происходит за счет того, что культивирование в условиях протока позволяет получать большие количества биомассы, а также поддерживать культуру 20 в одной и той же фазе роста при постоянной концентрации источника углерода в среде, что является необходимым условием для получения фермента с высокой метанолокисляющей 25 активностью, Эффективность процесса повышается и за счет использования в качестве источника углерода этилового спирта, что упрощает технологию. 30

Способ осущес твл яют следующим о6разом, Дрожжи Candida methy2ica ИБФМ—

670 культивируют на синтетической питательной среде следующего состава: (ИН4)2НРО4 0 5 г/л; NH4H2P04.

1,5 r/л; КИОб4,0 г/л; NgSO4 0,25 г/л, дрожжевой автолизат 0,01 г/л, этиловый спирт 0,01-0,1 o6, %, Культивирование проводят в ферментере в непрерывно-пpo;"o÷ном режиме с коэффициентом разбавления 0,1.-0,05 ч- при аэрации, рН среды 6,0.

Для выделения фермента биомассу разрушают путем рас тирания стеклянными бусами и центрифугируют, супернатант хроматографируют на ДЕАЕ-целлюлозе. Активность полученного препарата по метанолу 7100 нм/мг белка мин, Пример 1.В качестве продуцен- 50 га используют штамм метилотрофных дрожжей Candida methygica ИБФМ У—

670,который хранится в коллекции ин ститута биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР в г.Пущино- a.- ке 55

Штамм защищен авторским-свидетельством Р 449933, кл. С 21 С 21/18.

Дрожжи культивируют на минеральной с реде следующего сос тав а, г/л: (МН4 ) У НРО4 0 5; НН4 Н2 РО., 1, 5; KNOy

4,0; М9БО4 О, 25; дрожжевой автоли- еО з ат О, 01. Вода дистиллированная.

Значение рН среды доводят соляной кислотой до о,0, Стерилизацию среды проводят при 1 атм 20 мин. В качестве источника Углерода используют эти- $5 повый спирт, который добавляют посла . терилизации в количестве 0,05 об.

Для выращивания культуры используют ферментеры фирм LKB (Швеция) или В.Braun Nelsunger (ФРГ). Культивирование проводят в непрерывно-проточном режиме по хемостатному принципу. Для предотвращения вспенивания в среду добавляют силиконовое масло (0,01 %), Подача среды осуществляется регулируемыми перистальтическими насосами. Коэффициент разбавления Д=0,1-0,05 ч . Аэрацию проводят воздухом из расчета один объем в минуту на один объем среды. Скорость вращения мешалки 400 об/мин, Температура среды культивирования 28 С, о

Значение рН среды поддерживают постоянным (6,0) при автоматической подаче щелочи (0,5 % NaOH) . Рост культуры измеряют по плотности суспензии, Выходящую из ферментера суспено зию клеток охлаждают до 2 С и подвергают сепарирова ию на суперцентрифуге при 2800 об/мин . Отсепариро-. ванные клетки (20 г) суспендируют в

40 мл О, 1 м фссфатного буфера. (КН РО4- NaOH, рН-7,5), содержаще2 го 1 мМ дитиотрейтола и разрушают на СР-дезинтеграторе (Швеция) при скорости вращения мешалки 3000 об/мин в течение 25 мин, Гомогенат центрифугируют в течение 1 ч при 4000 g °

Супернатант разводят 0,02 М фосфатным буфером с дитиотрейтолом (1мМ) до 100 мл и используют для ионообменной хроматографии на колонке с

ДЕАЕ-целлюлозой, урав нов ешенн ой тем же буфером. Элюирование проводят с помощью ступенчатого градиента, получаемого добавлением к исходному буферу NaCI, Препарат алкогольдегидРогеназы элюируется 0,2 М ИаСХ.

В результате,ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы, очищенный в 20 раз и обладающий высокой удельной активностью по метанолу (7100 нм/мг белка мин) .

П р .и м е р 2.Дрожжи Candida methyXica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрациии 0,02 об. %, После выделения фермента, осуществленного способом, описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы, очищенный в 20 раз, с

Удельной активностью по метанолу

1200 нм/мг белка мин, Пример 3.Дрожжи Candida methygica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,1 об. %. После выделения фермента, осуществленного способОм, описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алко763464

Составитель, Н. Паников

Редактор T. Девятко Техред И.йсталош

Корректор С,шекмар

Заказ .6234/25 Уираж 522 Подписное

BHHHHH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент ., г.Укгород, ул.Проектная, 4 гольдегидрогеназы, очищенный в 20 раэ, с удельной активностью по метанолу 500 нмlмг белка мин, Предлагаеьий способ позволяет получить НАД-зависимую алкогольдегидрогеназу с высокой метанолокисляющей активностью (в 15 раз выше, чем в известном способе), а также повысить эфФективность процесса эа счет применения проточных условий культивирования и использования нетоксичного этилового спирта как источника углерода.

Формула изобретения

Способ получения НАД-зависимой . алкorольдегидрогеназы,предусматривающий культивирование.продуцирующих ее дрожжей при аэрации на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфата, минеральные соли и спирт в качестве источника угледора, с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю шийся тем что, с целью повыше" ния метанолокисляющей активности фермента, в качестве продуцента используют дрожжи СапйЫа methyLica.

ИБФМ у-670, а культивировайие ведут в проточныМ условиях, при этом в качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации

10 0,01-0,1 об. Ъ.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Семискер Я.A. Микельсаар С.К., Хейнару Э,Х, Окисление метанола НАДспецифичной дегидрогеназой метанол-. усваивающих дрожжей. — "Микробиология, 1977., т.46, вып.1, с. 169-171.

2.Netra R.J. Pyridlne NucleotideLinked. Oxidation of methanol in metanol-assimilating yeasts Journal of

20 BacterioIogy, 1975, 124, 9 3, 1165-11S7.