Способ получения глюкозоизомеразы

Способ получения глюкозоизомеразы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

< «764617 (61) Дополнительный к патенту рцМ. К,.з (22) Заявлено 170278 (21) 2540996/

/2584101/28-13 (23) Приоритет 1710.77 (32) 20. 10. 76

С 12 0 13/10

Государственный комитет

СССР но дедам изобретений и открытий (31) 734222 (33) США

Опубликовано 1509ВО.Б«оллетЕнь ¹ 34 (53) УДК 577. 15. 07 (088.8) Дата опубликования описания 1509.80 (72) Автор изобретения

Иностранец

Чин Ки Ли (США) Иностранная фирма

"P.Жд.Рейнольде Тобакко Компани" (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ

Изобретение относится к способам микробиологического получения ферментов изомеризации глюкозы и может быть использовано в пищевой промышленности для конверсии глюкозы в фруктозу, в частности при производстве фруктозных сиропов из кукурузного крахмала.

Изомеразу глюкозы, применяеМую для такой конверсии, получают из микроорганизмов, относящихся к различным родам, включая Arthrobacter

Streptomyces, Bacillus и Actinophanes.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ (11, согласно которому в качестве продуцентов глюкоэоизомеразы используют микроорганизмы вида Flarobacterium devorans.

Недостатком известного способа является невысокий уровень активности штаммов, продуцирующих фермент.

Целью изобретения является ïîâûшение ферментативной активности.

Поставленная цель достигается, тем, что в качестве продуцента глюкозоизомеразы используют штамьаа

Flavobacterium arborescens ATCC 4358

2 или Fl avobacte r i un arbore scen s NRRL

В-11022, или F l avobac ter i um" a rbo

rescens NRRL В" 11023.

Указанные культуры хранятся i

5 Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 4358 и в Коллекции культур ARS Северной региональной исследовательской лабораторин

Министерства земледелия США в Паории, 10 штат Иллинойс, под eNRRL 8-11022 и

NRRL 8-11023.

Все три штамма продуцентов характеризуются сходными морфологическими, культуральными и физиологичес15 кими признаками.

Палочки размером 0,5 х 2,5 мкм, : . одиночные и в цепочках, неподвижные, грамположительные, на ста«давтных питательных средах образуют длинные, 20 волнистые нити.

На желатиновой среде колонии сна- чала нитевидные и ветвистые, затем центр становится желтоватым, а край — полупрозрачным и древовидным.

25 Желатиновый столбик разжижается, плавится с образованием желтого осадка.

На жидком бульоне рост бактерий в виде суспенэии с желтым осадком, 3р без тонкой пленки. Молоко-коагулиру764617 ют без подкисления. На картофеле рост интенсивный в виде оранжевой

"пленки. Нитраты не усваивают, нитриты не образуют. Аэробы или факультативные анаэробы.

Оптимальная температура 30 С.

В дополнение к укаэанному выше

F. arborescens АТСС 4358 характеризуется способностью к интенсивному сийтезу фермента при культивирова- нии на питательной среде, содержащей ксилозу в качестве единственного уг« левода, на глюкозе или лактбэе активность фермента низкая. Штамм

F. arborescens NRRL В-11022 проявляет значительную изомеризующую ак тивность при культивировании на питательной среде с лактоэой и малую активность на среде с глюкозой. Штамм

F. arborescens NRRL В-11023 характеризуется высокой изомеризующей активностью при культивировании на питательной среде, содержащей глюкозу или лактозу.

Описанные микроорганизмы можно выращивать в различных средах, содержащих йс:точники углерода, азота и неорганические соли. Типичная среда состоит иэ гидролиэованного животйого протеина, кукурузного сока, экстракта пивных дрожжей, дигидрофосфата калия и соответствующего углевода (ксилоза, глюкоза, мальтоэа, сахароза и лактоза, гидролизаты ксилана, крахмала и целлюлозы). Начальный рН питательной среды должен равняться приблизительно 7, ферментацию следует проводить в аэробных условиях при температуре приблизительно 30 С в подходящем ферментере или качалочной колбе. Максимальная активность изомеразы достигается через 48-72 ч.

Активность глюкозоизомеразы определяют путем инкубации при 60ОС в течение 30 мин смеси, состоящей из

0,5 мл содержащего фермент препарата и 1,5 мп раствора, содержащего декстроэу (1,0 M), трициновый буферный раствор (рН 8,01 M) и хлорид магйия (0,03 M). По истечении инкубационного периода реакцию изомеризации прекращают путем добавления 0,5 мл

1,0 н.раствора соляной кислоты. После центрифугирования всплывающую прозрачную фракцию разбавляют и определяют продуцированную фруктозу. Активность глюкозоизомераэы выражают в микроединицах, одна мнкроединица активности соответствует количеству

Фермента, необходимого для образования 1 MKr фруктозы в 1 мин при приведенных выше условиях опыта.

Найдено, что количество иэомеразы, продуцированное предложенными штаммами при благоприятййх условиях культивирования, довольно эначйтельно и гораздо больше, чем количество, образуемое другими известными ранее продуцентами изомераэы. Особенно интересным и неожиданным является тот факт, что максимальное продуцирование изоглераэы штаммом NRRL В-11022 достигается в тех случаях, когда в

5 составе питательной сред применяют лактоэу. Например, в среде, содержащей 2% лактозы, ферментативная активность составила 2892 микроединиц изомераэы на 1 мл (мкед/мл ) ферментационного бульона. Следовательно, штаммы согласно изобретению характеризуются и отличаются от известных ранее микроорганизмов тем, что могут продуцировать значительные количества (50 0 мкед/мл буль он а или более)

15 активной глюкоэоизомеразы при культивировании в питательной среде, содержащей лактоэу в качестве единственного источника углеводов. Довольно значительное продуцирование фер29 мента происходит также при полном отсутствии углеводов в питательной среде. Это иллюстрируется данными, приведенными в табл. 1, полученными при культивировании при 30 С штаммов

F. arborescens в питательной среде, содержащей (% ) 1 гидролизованного животного протеина, 1 кукурузного сока, 1 экстракта пивных дрожжей, 1 моногидрофосфата калия, 0,5 дигидрофосфата калия и 2 углевода.

Глюкоэоизомераэа, продуцированная

F. arborescens, проявляет высокую активность в интервале рН 6-10 и в температурном интервале 45-90 С. В табл. 2 показано влияние рН, в табл. 3 — температуры на активность изомеразы, ассоциированной с цельными клетками, полученными путем культивирования NRRL В-11022 в содержащей лактозу Питательной среде при 30 С в

4р течение 72 ч. Затем собранные клетки были промыты один раз и повторно суспендированы в воде до первоначальной концентрации клеток в ферментационном бульоне. Для определения активности изомеразы применялась описанная выше стандартная метбдика определения за тем исключением, что при исследовании влиянця рН изменяли буферный раствор, а при исследовании влияния температуры изменяли температуру. Стабильность изомеразы оценивали путем выдерживания промытых клеток в 0,05 М трициновом буфере, рН=8), содержащем хлорид магния (0,004 М) при разных

55 температурах с последующим периодическим отбором проб для определения активности Фермента, результаты приведены в табл. 4.

Из данных табл. 4 видно, что фер 0 меит существенно стабилен в течение по меньшей мере 200 ч при рН 8 и температуре 60 С, как установлено путем исследования промытых клеток, содержащиХ фермент. Препарат фермен та из промытых, клеток характеризует-.

764617

1,0

1, 0

1,0

1,0

0,5

2,0

Продуцирование глюкозоизомеразы микроорганиэмамн

F. arborescens

1042 1480

892 . " 775

89 1123

2892 1679

Без углевода

Ксилоза

Глюкоза

Лактоза

Мальтоэа

1314

Сахароза

1190

П р и м е ч а н и е. Время продуцирования 72 ч. ся, кроме того, тем, что, сохраняет по меньшей мере 85% активности при нагревании в течение 20 ч до темпе» ратуры 70 С при рН 8.

Изомераза, продуцируемая F.. агЬоrescens, очень эффективна для конверсии глюкозы в фруктоэу, и для такой конверсии могут быть применены различные способы, уже описанные ранее.

Пример 1. В колбу Эрленмейера емкостью 500 мл поместили 100 мп питательной среды следующего состава,Ъ:

Гидролизованный животный протеин

Кукурузный сок

Дрожжевой экстракт

К НРО

КНрРО4

Лайтоза

Указанную среду инокулируют свежеприготовленным посевным материалом бактерий F. àr borescens NRRL В-11022 и инкубируют на качалке при 30 С.

По истечении 72 ч клетки собирают и промывают. Активность иэсмераэы составила 2892 мкед/мл исходного бульо» на..Пример 2, Повторяют опыт, описанный в примере 1, эа тем исключением, что в питательной среде лактозу заменяют ксилозой и посевной материал готовят из F. агborescens

ATCC 4358. Через 72 ч клетки собира ют и промывают. Активность иэомеразы составила 546 микроединиц на 1 мп бульона.

Пример 3. Повторяют опыт, описанный в примере 1, за тем исключением, что s питательной среде лактозу заменяют глюкозой и посевный материал получают иэ F àrborescens

Мйй 8-11023. По истечении 64 ч активность изомеразы составляла 580 микроединиц на 1 Мл бульона.

Пример 4; Культивируют Р. агЬогезсепз ййй. 8-11022 при

30 С в течение 70 ч в ферментере

new Bruuswlck емкостью 10 л с применением питательной среды, описанной в примере 1. Клетки собирают и иммобилизуют методом фЛоккуляции, описанным в патенте СШ 93821086. Получают агрегат высушенных флоккулированных клеток с активностью иэомеразы 75 микроединиц на 1 грамм.

I""..

Таблица 1

764617

Таблица 2

Влияние рН на активность изомеразы, продуцируемой F. arhorescens ЯВИ

В-11022

БуФер — P XP KS

6,0

598

1204

6,5

1782

7,0

7,5

2202

БуФер — трицин

2624

7,5

3016

8,0

&,5

3456

3408

9,0

PIP)S — натриевая соль 1,4-пиперазиндиэтансульфоната. % Трицин — й- t2-окси-1, 1-бис- (оксиметил) -этил)-глицин.

Таблица 3

Влияние температуры на активнбсть изомеразы продуцируемой F. arborescens NRRL В-11022, при рН 8,0

775

1717

2 776

3500

4400

5104

5960

6592

7088

764617

Таблица 4

Стабильность ъ омеразы, продуцируемой F. arborescens NRRL В-11022> при разных температурах

2340.

2212

2276

2244

2036

2276

168

2092

2262

240

Составитель Н.Паников

Техред М.Рейвес Корректор Н.Стец

Редактор Е.Хорина

Заказ 6317/52 .Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

Способ получения глюкоэоизомеразы, предусматривающий культивирование продуцирующих Фермент микроорганизмов на средах, содержащих

:источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим извлечением Фермента, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности, в качестве продуцента глюкоэоизомераэы используют штаммы F1а оЬасterium

arborescens ATCC 4358, или Р1ачобаcterium arboresceus NRRL В-11022, или Flavobacterium arboresceus NRRL

В-11023.

Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США Р 3956066, кл. 195/31 F, опублин. 1976.