Способ диагностики альвеококкоза

Способ диагностики альвеококкоза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Социалистических

Республик

<л766583

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (51)М. Кл. (22) ЗаяsлeHо 110377 (21) 2464346/28 — 13

2624057/28-13

A 61 В 10/00 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий

Опубликовано 30,09.80.Бюллетень ¹ 36

Дата опубликования описания 3009.80 (53) УДК Ь 616-07 (088. 8) (72) Авторы изобретения

Н. E. Баллад, М. В. Далин и Е. A Коврова

Ордена Трудового Красного Знамени институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е,И, Марциновского (71) Заявитель (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЬВЕОКОККОЗА

Изобретение относится к области медицинй, а именно диагностике паразитарных заболеваний.

Известен способ диагностики альвеококкоза путем сенсибилизации эритроцитов антигеном, сведения их с испытуемой сывороткой с последующим учетом результатов их взаимодейтсвия, Однако известный способ не обес- 1р печивает высокой чувствительности и специфичности диагностики.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности диагностики.

Это достигается тем, что эритроциты сенсибилизируют очищенным антигеном с молекулярным весом выше

600000, выделенным из альвеококка, и при положительной реакции в титре

160 и выше диагностируют альвеококкоз.

Способ осуществляют следующим об.разом, Цельный экстракт гомогенизирован- 25 ных ларвоцист альвеококка, выделенных от хлопковых крыс, наносят в ячейку с мембранным фильтром марки

ХМ 100 для отеделения и концентриро вания фракции с молекулярным весом выше 100000 от веществ с меньшим молекулярным весом. Фракцию с молекулярным весом выше 100000, составляющую 80,2% белка цельного экстракта для дальнейшего разделения и концентрации диагностически ценных антигенов альвеококка, наносят затем на ячейку с мембраной марки ХМ 300.

Фильтрация через мембрану позволяет получить в концентрате фракцию с молекулярным весом выше 300000, содержащую 28,2% белка цельного экстракта ларвоцист, включающую основные дйагностически ценные антигены паразита, антитела к которым имеются у большинства больных альвеококкозом.

Дпя последующей очистки фракции оФ белков хозяина ее наносят на колонку с сефарозой 4В. Разделение ведут в

0,5% NaCE при скорости элюции

2,5 мп/чсм, Пробы собирают на автомагтический коллектор по 3 мл. По данным иммунохимического анализа элюат делят на 4 подфракции.Две из них (91,2)содержат по одному антигену паразита,очищенному по данным реакции двойной диффузии в геле (РДДГ),от бел ков хозяина.В состав третьей подфракции входит 4 антнгена паразита и 2

766583 антигена хозяина. Четвертая подфракция, входящая во внутреннем объеме колонки, представляет собой смесь антигенов паразита и хозяина с преимущественным содержанием последних. Первые три фракции содержат соответственно „Ъ:

21 3,51; 8,5 белка фракции концентрата XN 300, что составляет „0, 58; 1, 01;

2,4 всего исхоцного белка цельного экстракта, в то время как в состав чечетвертой подфракции входит Йб Ъ белка фракции или 24,2Ъ цельного экстракта, что свидетельствует о значительной очистке трех первых подфракций и невысоком процентном содержании отдельных активных антигенов альвеококка в исходном материале.

Проведение реакции непрямой гемагглютинации с очищенными антигенами альвеококка, Перед танизацией консервированные фОрмалинОм эритрОциты отмывают три раза (два раза физиологическим раствором и один раз буфером рН 7, 2 при

2, 5 т об/мин 3-5 м1н) .

Сост ав буфера, мп: 0, 15 N

NaPO4 72; 0,15 N КН РО4 28:

0,9Ъ ИаСХ 900.

Затем к 2, 5Ъ суспензии эритроцитов вливают 1: 1 раствор танина в бу— фере (1:20000) и полученную смесь инкубируют в термостате 20 мин при

37 С. После этого эритроциты отмываются три,раза буфером при 2 т об/мин 3-5 мин и ресуспендируют в

2,5Ъ концентрации в буфере.

Лиофилизированный порошок антигенов альвеококка растворяют в буфере до концентрации белка, мг/мл: в I фракции 0 04„ во II фракции 0,19; в III фракции 0,.17, Танизированные эритроциты соединяют с равными объемами антигенов и полученные смеси оставляют на 20 мин в термостате и 40 мин при комнатной температуре, Затем эритроциты, сенсибилизированные антигеном (диагностикуеы), отмывают 3 раза,, ресуспендируют в превоначальном объеме ((2,5Ъ суспензия), кон сервируют мертио латом (1 10.000 конечная концентра-ция) и оставляют в холодильнике до следующего дня.

° Приготовление сывороток для реак ции, Все сыворотки (испытуемые, положи— тельная контрольная сыворотка и нормальная кроличья, на которой ставят реакцию, т. е. раз водящая) ин активируют, т, е. выдержи вают 30 мин в водяной бане при 56 С. После инактивации сыворотки адсОрбируют: к 1 мл сыворотки добавляют 0,2 мл отмытых консервированных эритроцитов и выдерживают не менее двух часов, Пе ед пос-. тановкой реакции норман ..;.,:и кроличью сыворотку разводят !.:О"..: на ней готовят последовательно двукратные разведения испытуемых сыВоротОК и контрольной положительной, начиная с

1/20 960 (12 разведем ний) . Реакцию проводят в аглютинационных досках, Для испытания сыворотки с тремя диагности кумами (I, II u III фракции) готовят четыре ряда (по 0,25 мл в каждой лунке) последовательных двукратных разведений, В первые три ряда

1О закапывают диагностикумы по две капли в каждое разведение сыворотки, а в четвертый ряд — танизированные эритроциты (контроль сыворот ки), Нео бходим т акже контроль ди агно сти кумов: 5 испытание их с разведениями заведомо. положительной сыворотки и больного альвеококкозом, и с разводящей сывороткой (3-4 лунки).

Реакцию в зависимости от ее интенЯ сивности оценивают по четырехплюсовой системе: ++++ — компактный кле— точный агрегат; +++ — ровный слой клеток со складчатыми краями на дне лунки; ++ — ровный слой клеток, края

25 ме ст ами зазубренные; + — темное уз кое кольцо окружает края слоя клеток;

+- — толстое темное кольцо окружает края слоя клеток, покрывающего малую поверхность; — плотный круглый осадок клеток, так называемая пуговка, За положительный результат принимали положительную реакцию не менее, чем на три креста с титром .сыворотки

160, принятом за диагностический.

Определение сравнительной активности ди агно сти кумов и з очищенных антигенов альвеококка и из цельного антигена эхинококка (жидкости ларвоцист) показало преимущество для диагностики гомологичных антигенов (табл, 1) .

40 Положительная реакция в диагностическом титре и выше наблюдалась с ди агностикумом из I фракции у 88, 8Ъ сывороток больных альвеококкозом, иэ

ХХ фракции — с 88, б Ъ сывороток больных, из III фракции — с 92, ЗЪ, в то время как с диагностикумом из цельного антигена эхинококка реакция была положительна всего лишь с 80,9Ъ сывороток больных альвеококкозом

59 (табл. 1) . Вариабельность иммунного ответа при данном гельминтозе требует использования в диагностике и соответствующего набора антигенов.

Поэтому одновременное использование у трех очищенных антигенов поз воляет еще больше повысить чувствительность реакции, так как сыворотки больных альвеококкозом, давшие отрицательный результат с одними антигенами, были положительны с другими, бО

Сравнительные ан ализы активности

РНГА с очищенными антигенами альвеококка и цельным антигеном (жидкость ларвоцист) .эхинококка приведены в табл. 1 и 2 °, 766583

Т а бл и ц а 1, и В ительдиагеском и вы0 04

I фракция

15 (88,8)

31 (88,6)

II фракция 0,19

I II фракция

0,17

12 (92, 3) Цельный антиген

0,30

34(80,9) эхинококка

Таблица 2. тра елка нси ции ци/мл

Антиге

11 (100)

25 (100)

11(100) I фракция 0,04

II фракция 0,19

I II фракция О, 17

Цельный антиген эхинококка

392 (96) 0,30

408

Формула изобретения

Подписное

Тираж 673

Филиал ППП Патент, r. ужгород, ул. Проектная, 4

Испытание. очищенных антигенов альвеококка с контрольными сыворотками, полученными от больных другими забо.леваниями, показало в РНГА более высокую специфичность их по сравнению с цельным антигеном эхинококка.

Ни одна из контрольных сывороток не давала положительного результата ни с одним из гомологичных антигенов 50 (специфичность 100%), в то время как антиген эхинококка имел специфичность

96Ъ (табл, 2) . Высокая специфичность фракций позволила установить более низкий диагностический титр (160), по 55 по сравнению с диагностическим титром (320), принятом.при исследовании сывороток в РИГА с антигеном эхинококка.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую чувствительность и специфИч-!. ность, увеличивает надежность диагносВНИИПИ Заказ 7036/2 тики альвеококкоза, позволяет выявить более высокий процент больных на ранней стадии заболевания и не дает ложноположительных результатов.

Способ диагностики альвеококкоза путем сенсибилизации эритроцитов антигеном, сведения их с испытуемой сывороткой с последующим учетом ревультатов их взаимодействия о т л ич аю щи и с я тем, что, с целью повьйаения чувствительности и специфичности диагностики, эритроциты сенсибилизируют очищенным антигеном с молекулярным несом выше 600000, выделенным из альвеококка,и при положительной реакции в титре 160 и вьиае диагностируют альвеококкоз.