Способ выделения и очистки трипсина и химотрипсина
Патент 767121
Авторы
Способ выделения и очистки трипсина и химотрипсина
Иллюстрации
Реферат
ь.
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
„„767121
Союз Советсинн
Социапистическмн
Республик
*.®
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 20.11.78 (2 I ) 2686020/23.04 с присоединением заявки .% (23) Приоритет (5i)М. КЛЪ
С 07 а 7/îã//
G 01 и 31/08
Гееударстеенный комитет
СССР
Опубликовано 30 09.80. Бюллетень J4 36
Дата опубликования описания 3009;80 ао делам нэабретеннй и атнрмтнй (53) УДК 577.15. .07 (088.8) В.Г. Бендикене, P. В. Берзиня-Берзите, И.-Г; И. Песлякас, В. Г. Кирсе, В. С. Веса и А.— С. А. Глемжа (72} Авторы изобретения
Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ТРИПСИНА
: И ХИМОТРИПСИНА с
Изобретение относится к области эйзимологии и родственным ей областям науки и про- мышленности, использующим высокоочищенные ферменту. Высокоочищенные трипсин и химотрипсин могут быть использованы в фармацевтической, медицинской и пищевой промышлен1 ости, а также в ряде областей науки — молекулярной биологии, биохимии и т. д.
В современной энзимологии для выделения и очистки трипсина и химотрипсина весьма успешно применяется метод биоаффинной хроматографии с использованием биоспецифических сорбентов, полученных на основе синтетических или природных ингибиторов указанных фермен тов.. Однако биоспецифические сорбенты; получен-. ные на основе специфических синтетических низкомолекулярных ингибиторов трипсина и: химотрипсина, являются пригодными для раздельной очистки данных ферментов, и лишь в отдельных случаях достигается одновременное разделение и очистка трипсина и химотрипсина, и то при условии использования предварительно очищенных ферментных препаратов,(1).
С другой стороны, биоспецифические сорбентьт, полученйые на основе природных ингибиторов трипсина, позволяют проводить одновременный процесс выделения и очистки трипсина и химотрипсина непосредственно из сырых экстрактов, но возможность применения таких сорбентов в препаративных масштабах ограничивается в связи с дороговизной их получения и низкой устойчивостью к химическим и микробиологическим воздействиям. :, Известен способ очистки частично очищенных препаратов трипсина и - химотрипсина гидрофобной высаливающей хроматографией на бензилагарозе, заключающийся в сорбции ферментов в 0,1 M цитратном буфере рН 3,0, содержащем
3 М NaCI и десорбции ферментов градиентной люцией градиентом NaCI. в концентрации 3,0 М в исходном буфере или линейным градиентом от исходного буфера с 3 М NaCI до исходного буфера с 507о этиленгликоля (2).
Однако существующий способ обладает следу ющими недостатками:
1) исходная матрица, используемая для синтеза сорбента сефароза, дброгостояший, низко767121
30 ед/мг белка
4$
3 стабильный к действию химических реагентов, легко подвергаемый действию микроорганизмов материал ; ) в таких условиях провеления хроматографии трипсина или химотрипсина на бензилагарозе с содержанием бенэильных групп 900 мк М/г носителя наблюдается незначительное повышение удельной активности десорбируемого фермента (для трипсина от 0,90 ед/мг до 1,3 ед/мг, для химотрипсина от 970 ед/мг до 1100 ед/мг) в 1,2 — 1,4 раза, при этом выход активного фермента составляет всего лишь 40-55%;
3) в указанных условиях проведения хроматографии даже наличие таких агентов, как
3 М NaCI или 50% этиленгликоль не обеспечивает количественных выходов десорбции посторонних белков, что может привести к постепенному загрязнению колонки с сорбентом и трудности его регенерацик, 4) отсутствуют какие-либо данные о возможности выделения и очистки трипсина и Мимотрипсина непосредственно из сырых экстрактов и возможности поочередной десорбции ферментов при их совместной сорбции на сорбенте.
Целью предлагаемого изобретения является
° повьлпение выхода и степени очистки целевых ферментов и упрощение процесса их выделения и очистки.
Поставленная цель достигается, согласно изобретению, описываемым способом выделения и очистки трипсина и химотрипсина, включающим сорбцию ферментов в 0,002-0,005 М ацетате кальция при рН 6,9 — 7,1 на сорбенте, в качестве которого используют N-бенэилхитин с концентрацией бензильных групп 60 — 90 мк М/г и десорбпию, причем для десорбции трипсина используют 0,5- -0,6 Ч раствор NaCI в исходном буфере, а для десорбции химотрипсина 1,5 — 2,0 М раствор NBCI в исходном буфере.
Существенными отличиями описываемого способа являются использование в качестве сорбента N-бенэилхитина с концентрацией бензильных групп 60-90 мк М/г, использование при сорбции 0,002-0005 М ацетата кальция, рН
6,9 — 7,1, использование для-десорбции трипсина—
05 — 0,6 М раствора NaCI в исходном буфере, а для десорбции химотрипсина — 1,5 — 2,0 М раствора NaCI в исходном буфере.
Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что процесс сорбции — десорбции ферментов на бензилхитине осуществляется в мягких. условиях„обеспечивающих высокую степень сохрайения активности и очистки ферментов за счет наличия в сорбенте двух сорбционных центров (бензильных групп и белковой части хитина), способных к строго селективному взаимодействию с целевыми ферментами, тогда как в известном способе сорбция ферментов реализуется на бензильйых остатках
4 xl счет лсйствин неспецифических гилрофобных
d
Эти особенности N-бснзилхитина определяют условия проведения всего процесса хроматогра5 фии ферментов, что выражается и в том, что оба фермента десорбируются при flocTBTo÷íî раэличаюгцихся концентрациях солей в буферном растворе (как при хроматографии неочищенного нанкреатина, так и при хроматографии частично очищенных препаратов трипсина и химотрилсина), в результате чего достигается значительное повышение удельной активности трипсина (от
3 до 5 раз), химотрипсин достигает электрофоретически гомогенного состояния, Выход активных ферментов составляет не менее 70-80%.
Пример 1. Выделение и очистка трипсина и хймотрипсина из медицинского панкреатина..
Колонку (1,7х31 см), наполненную 10,63 г
N-бенэилхитина, уравновешивают 0,002 М раствором Са(СНэСОО)э рН 7,0 и наносят 50 мл раствора медицинского панкреатина в 0,002 М
Са(СНэСОО)э рН 7,0 концентрацией белка
2,6 мг/мл общей протеолитической активностью
0,15 казеиновых. единиц на 1 мг белка (каз. ед/мг). Скорость течения элюента 40 мл/ч.
После нанесения раствора медицинского панкреатина колонку промывают начальным буфером (0,002 М Ca(CH3COO) эрН 7,0) до отрицательной реакции на белок. После чего через колонку пропускают 0,5 М раствор NaCI в 0,002 М
Са(СНэСОО)э рН 7,0 до отрицательной реакции на белок (около 100 мл). Фракции с протеолитической активностью собирают, общий объем
60 мл, концентрация белка 0,87 мг/мл, получают 52„2 мг трипсина с активностью 0,10 каз.
После отделения трипсина через колонку пропускают 1,5 М раствор NaCI в 0,002 М
Са(СНзСОО)э до отрицательной реакции на белок (около 100 мл). Фракции,с протеолитической активностью объединяют: 60 мл с концентрацией белка 0,76 мг/мл, получают 45,6 мг а -химотрипсина с активностью 0,08 каз. ед/мг белка.
После диалиэа фракции с трипсином и с а -химотрипсином лиофильно высушивают.
Иэ 1 г медицинского панкреатина получают
28,0 мг трипсина, содержащего 85-90% белка.
Активность препарата 0,09 каз. ед/мг белка, что соответствует 67 ед. БАЭЭ/мг белка . (N-бензоил- 01 -аргининэтиловый эфир) .
Иэ 1 г медицинского панкреатина, кроме тряпсина, получают 23 мг химотрипсина. Активность препарата 0,08 каз. ед/мг белка. Гомогенность устанавливают методом электрофореза в полиакриламидном геле.
5 767121 d
ll р и м е р 2. Выделение и очистка шлифом и с хлоркальциевой трубкой в 33 ь1л трипсина и химотрипсина из препарата трипсина метанола (СНзОН) растворяют 0,135 г марки Ь/03XI (0,0009 М) безводного NaJ,прибавляют 167 мл
100 мг трипсина марки Б (производство абсолютного диоксана (общий обьем раствори03XP) с активностью 16 ед БАЭЭ растворяют 5 телей 200 мл), 0,228 г (00018 M) бензила в 25 мл 0,002 М Са(СНэ(ОО)з, РН 7,0, фильт- хлористого, 0,227 г (0,0027 М) натрия двуутлеруют и заносят на колонку, наполненную кислого и 15 r сухого хитина. Смесь перемеши10,63 r N-бензилхитина, (1.7x3I см) и предва- вают в течение 15-20 ч, нагревая на водяной рительно уравновешенную 0,002 М Са(СНэСОО) t базе при температуре реакционной смеси 50—
РН 7,0. Скорость течения элюента 40 мл/ч. о 60 С. По окойчании реакции сорбент на стекПосле нанесения раствора трипсина на колонку лянном фильтре промывают абсолютным диокее промывают тем же раствором 0,002 М саном, ацетоном 2-3 раза (для удаления NaJ), Са(СНэСОО)2 РН 0,7 до отрицательной реакции фильтрат отбрасывают, колбу Бунзена — приемля белок. После чего через колонку пропускают ник заменяют иа сухую и сорбент тщательно
0,5 раствор NaCI в 0,002 М Са(СНэСОО) 2 15 промывают водой (для удаления NaCI), фильтРН 7,0 до отрицательной реакции на белок рат и промывные воды переносят в мерную (около 100 мл). Фракции с протеолитической колбу на 100 мл объем доводят до метки и в
J активностью собирают и после диализа лиофиль- нем определяют содержание ионов СГ титровано высушивают. Получают 20 мг трипсина с нием с раствором Нц(ИОз)эС1 . Параллельно активностью 75 ед БАЭЭ/мг белка. Степень. 2О определяют число l введенных бензильных очистки 4,6 раза. групп по оставшимся свободным аминогруппам
После отделения трипсина через колонку в полученном высушенном сорбенте (с салиципропускают 1,5 М раствор NaCI в 0002 M ловым альдегидом).
Са(СНэСОО)2 РН 7,0 до отрицательной реакции на белок. Так как препарат трипсина марки Б (ОЗХР) содеРжит маленькое количество < -химо- Ф о р м у л а и з î б р е т е н и я трипсина (примерно 6-11%), то для лиофильного высушивания такое количество недостаточно . Способ выделения и очистки трипсина и (из 100 мг препарата). Поэтому собирают химотрипсина, включающий сорбцию ферментов
: фракции с а -химотрипсином после нескольких на сорбенте — бензилпроизводном полисахарида
30 хроматограмм и тогда большее количество посл с последующей десорбцией их с сорбента NaCIдиализа лиофильно высушивают. солевым буферными растворами, о т л и ч аПример 3. Синтез сор ента- . ю щ и и с я тем, что, с целью повышения
3 интеэ со бента (М У 6-09-5113-68) и мельчают, просеивают чеРез набоР сит, отбиРают фракции и упрощения процесса, в качестве сорбента и хитина с РазмеРом частиц 0,3 мм, обрабатывают пользуют N-бенэилхиин с концентрацией бен35 при комнатной температуре 6 н. НС8 до пре- зильных групп" 60-90 мк М/г, сорбцию осукращения выделения СО2, перемешивая механи- ществляют в 0,002-0005 М ацетате кальция ческой мешалкой. Смесь фильтруют через при РН 6,9-7,1, десорбцию трипсина осуществля- стеклянный фильтр, промывают фильтратом, ют 0,5-0,6 М раствором NaCI в исходном) фильтруют (операцию повторяют 5-8 раз), про- буфере, а для десорбции химотрипсина исполь40 мывают 6 н.НС8, затем большим количеством зуют 1,5 — 2,0 М раствор NaCI в исходном буфедистиллированной водой до нейтрального значе- ре. ния РН, ацетоном, сушат при 100-105 С. . В сухом хитине определяют содержание Источники информации, свободных аминогрупп методом образования 45 пРинЯтые во внимание пРи экспеРтизе шиффовых оснований с салициловым альдеги- 1. J. Н. Branter, R.G.Medicus, R.À.Mc. Roric, дом, "FractIonation of Proteolytic Enzymes by Affi1 г хитина содержит 60 мк М свободных nity Chromatography on «Sepharose Aminocap— аминогрупп. Все количества остальных реаген- гоу! Prof levin", Journal of Chromatography, тов высчитывают на 1 моль аминогрупп. 5о 129.1976,97-105;
На синтез сорбента берут 15 г хитина, коли- 2. Torgny Laas, "BenXylated 0ibromopropanol чество свободных аминогрупп в котором состав- Cross — Linked Sepharose As an Amphophil c ляет 15x60=900 мк M = 09 мЫ = 0,0009 моль. Gel for Hydrophobic Salting — Out ChromatograpB трехгорловой круглодонной,колбе, соеди- hy of Enzymes with Special Emphasis on 0ena— ненной с обратным холодильником, механичес- 55 turing Risks", Journal of Chromatography, 111, кой мешалкой, термометром со вниз сходящим 1975, 379-387 (прототип).
В I IHHIlH Заказ 7128/21 Тираж 495 Подписное
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4