Способ получения бактериальной эндонуклеазы 1

Способ получения бактериальной эндонуклеазы 1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ii»767197

Согоэ Советских

Социалистических

Республик оп -йе

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт, свид-ву (51)М. Кл. (22) Заявлено 301178 (21) 2699576/28-13 с йрисоеди нейдем- заявки гго (23) Приоритет

С i2 О 13/1.0 г осуяарствеииый комитет

СССР ио делам изобретений и открытий — =- -- Опубликовано 3009.80. Бюллетень Йо 36

Дата опубликования описания г00980

М) >Д< 577. i5.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Б,С.Народицкий, И.N.Ãðóáåð, Н.B.Öâåòêîâà, И.Э.Семина и Н.П.Ванеева

Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова и Институт вирусологиИ им. Д.И.Ивановского ANH СССР (71)Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАК1ЕРИАЛЬНОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

Seiner

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам получения бактериальных ферментов.

Известны способы получения бак- 5 териальной эндонуклеаэы Sa Р Х, в которых так же как и в предлагаемом изобретении проводится получение биомассы, разрушение клеток, выделение активной фракции, очистка 30 и концентрирование Фермента fl).

Описанный способ получения фер" мента отличается, однако, большой трудоемкостью и низким выходом фермента. 15

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ (2), согласно которому штамм

Streotomyces afbus выращивают на питательной среде, содержащей 1 r/ë 20 дрожжевого экстракта, 1 г/л мясного экстракта, 2 г/л триптоэы и 10 г/л глюкозы. Условия подготовки культуры и выращивания авторами не приЮодятся.

Культивирование происходит при 25

32 С, выход биомассы составляет

1,8 г/л. 1ля выделения активного препарата используют следующие операцииг 10,5 r влажных клеток суспендируют в 20 мл 6yhepa,.содержа- щего О, 01 М трио-HC0 (pH = 7, 5), 0,01M)5 -меркаптоэтанола, и подвергаг ют разрушению на ультразвуковом дезинтеграторе 20 раз по 30 с при

0 С. Экстракт центрифугируют при

35 тыс. об/мин в течение 30 мин при

+4 С.В суспернатант добавляют МаСх до концентрации I М и фракционнруют на колонке с биогелем A. 0,5 гтг в буфере того же состава. Активность фракций проверяют в реакции фрагментации ЛНК Aab 12. В работе отсут. ствуют данные по выходу Фермента.

Удельная активность препарата составляет 2 мкл/13 ЦНК, т.е. в 1 мл содержится 500 условных единиц активности фермента.

Недостатком такого метода является незначительный выход биомассы н низкая удельная активность ферменга . Полученный фермент не может длительно храниться, а должен быть использован сразу.

Целью изобретения является повыггение ахтивности и выхода фермента.

Поставленная цель достигается тем, что культивирование продукта ведут на среде Гауэе прн 27-28, а полученный ферментный раствор дополнительно очищают путем хрома767197

Таблица 1

9 серии ичесусловединиц ивности мкл ое коо едини сти

30000

32000

Таблица2.ть

7 мес

5 ме

+++ +++ +++ ++

+++ +++- +++

+++ +++ +++

+++ .+++ +++ тографии на гепарин-сефарозе и диализуют против буфера с 50%-ным глйгГерйном, причем в процессах хроматографии фермент стабилизируют глицерином.

Полученный фермент строго специфи. чен, так как Фрагмемтирует,ЦНК фага 3 на два участка. Препарат практически свободен от неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеазной активности, что было проверено реакцией в агарозном геле с Jl ДНК и,ДНК плазмиды Col EI. Полученные в результате действия фермента рестрикты имеют . липкие концы и способны лигироваться. Это является дополнительной характеристикой высокой степени очисПример. Культуру Strepto-.

myces a9hus g выращивают на питатель- ной среде следующего состава, г/л: бульон Хоттингера 301 хлористыи натрий 51 пептон 5 глюкоза 10 (среда Гаузе 2) . Посев проводят в 0,5 л колбу s 100 мл среды, культивируют тров суток на качалке со скоростью

100-120 кач/мин, затем пересевают в пятилитровую бутыль с 2 л среды (на 2 л среды - 100 мл посевной культуры). Культуру выращивают трое суток при тех же условия с)культивирования. Температура культивирования 27-28 . Отделение биомассы

D йроводят центрифугированйем. Ко нечный выход биомассы составляет

37-40 г/л. Выращивание в предлатки препарата и отсутствия в нем неспецифических эндонуклеаз и экэонуклеаэной активности. Характерис.тика Фермента ЯаР 1 приведена в табл.

1, в табл. 2 приведейа характериСтика его стабильности. Удельная активность: препарата составляет D, 5 мкл/Ц ДЙК, т.е. 1 мл: препарата содержит 2 тыс. условных единиц активности. Иэ 5 г биомассы получают 25-30 тыс. Условных единиц активности фермента (см. табл,l). Фермент может храниться в течение б месяцев без изменения его удельной активности (см. табл,2).

Способ получения фермента Яа0 I может бить воспроизведен в полупроиз15. водственных условиях, гаемом режиме позволяет получить р биомассу в стадии максимального накопления SaВ Х без значительных примесей неспецифических эндонук-. леаз и практически свободной от специфической активности Sa Q II.

Для выделения Фермента Яа0 Х 5 г замороженной микробной массы суспендируют в 10 мл буФера, содержащего 1 мМ трис-НС2, 10 мИ 3 — меркаптоэтанола (pH=7,9) и подвергают фф ультразвуковой дезинтеграции на йриборе фирмы MSE при 12 кгц

10 раз по 30 с. В интервалах между дезйнтеграциями тубус деэинтегратора охлаждают дистиллированным

Я льдом в течение 1 мин.

767197

Составитель Н.Паников

Редактор Г.Прусова Техвед Н,Бабурка Корректор М.вигула

Заказ 7135/23 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ЧПП Патент, r. ужгород, ул. Проектная, 4

Суспензию центрифугируют в тече ние 90 мин при 20 тыс. об/мин.Все операции проводят при температуре от

0 до + 4 С, К упернатанту добавляют.

НаС8до конечной концентрации 1 М.

Затем супернатант наносят на колонку с биогелем A 0,5 m (2,6 70 см), уравновешенную буАером, содержащим

10 мМ трис-Н< 10 иМф-меркаптоэтанола и 1 М ИаС (рН = 7, 4) .

Скорость нанесения образца и элюции Аракций устанавливают .с помощью перистальтического насоса (18 мл/ч) .

В пробирки перед сбором Аракций приливают по 500 мкл глицерина для стабилизации фермента. Колонку . промывают двумя объемами буАера, собирают фракции по 5 мл. Каждую фракцию проверяют на наличие в ней специфической эндонуклеазы SaC I в реакции фрагментации ДНК фага )r..

Активные фракции объединяют, днализуют против 3 л буфера, содержащего 20 мМ трис-НСР, 7,0 мЧ fb — меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЕДТА и 0,1% тритона ° 100 (рН 7,4). циализат наносят на колонку (О, 9 ° 4 см), заполненную гепаринсефарозой. Скорость элюцин 2,5 ил/ч.

Фермент Sat I не сорбируется На колонке, он свободно проходит через нее, на колонке остаются балластные белки, что приводит к значительной очистке Аермента. Активные фракции объединяют и диализуют против 50в-ного глицерина, приготовленного на буфере, в которои прохо-. дило разрушение микробных клеток, с добавлениеи в него 0,1 М NaCC. Концентрированные таким образом ripeпараты могут храниться без снижения активности до 6 месяцев при -20

Использование предлагаемогб способа получения бактериальной эндонуклеазы ЗаР I обеспечивает по сравнению с известными способами следующие преимущества: увеличение выS хода биомассы в 20 раз1. получение строго специфичного фермента беэ заметных примесей неспецифических эндонуклеаэ и экзонуклеазной активностиу полученный фермент позволяет полу1 чить Арагменты .ЦНК, способные к лигированиюу предлагаемый метод пригоден для полупроизводственного . получения фермента.

Аормула изобретения

Способ получения бактериальной

15 эндонуклеазы Sat I из Rtreotomyoes

aKbus, предусматривающий культивирование продуцента, ультразвуковую дезинтеграцию полученной биомассы,. отделение неразрушенных клеток ценЩ трифугированием с последующей очисткой центриАугата путем хроматографии на биогеле с получением ферментного раствора, о т л и ч а ю щ и йс я тем,что,с целью повышения активности и выхода Фермента, культивирование продуцента ведут на среде

Гаузе прн 27-28 Cg.а полученный Аерментный раствор дополнительно очищают путем хроматографии на гепарин-сеАарозе и диализуют против буфера с

50%-ным глицерином, причем в процессах хромотограАии АериЕит стабилизируют глицерином.

Источники инАормации, принятые во внимание при экспертиэе

1. +ihbets С. ЗопгпаВ о1 Ч1-

rotogy, 1977,V. 24, Ð 2,рр.564579.

2.groneberg j. Сей,. 1977, Ч. 10, рр.ll0-111 (прототип).