Штамм а-18-продуцент 5 -экзонуклеазы

Штамм а-18-продуцент 5 -экзонуклеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Сощиалистических

Республик

<и>7672 О4 (б1) Дополнительное к авт, свид-ву (22) Заявлено 21.07.78(21) 2659534/28-13

Щ K ç

С 12 N 15/00

С 12 0 13/10 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий

Опубликовано 300980. Бюллетень № 36

Дата опубликования описания 03. 10. 80 (53) УДК 577.15 (088.8) (72) Авторы изобретения

Т. В. Шахова, Г. И. Хомякова и С. А. Коновалов 7 1.) 3a я в и тел ь

5

Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (54) ШТАММ ACTINONYCES COELICOLOR А-18

ПРОДУЦЕНТ 5-ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической про- " мышленности и может быть использовано для получения 5 -мононуклеотидов,при- 5 с меняемых в пищевой промышленности для улучшения вкусовых качеств готового продукта и в медицине.

Известен штамм актиномицета Аст. nomyces-coeiicolor A-5, продуцирую- 1О щий внеклеточную 5 -экзонуклеазу.

Этот штамм характеризуется уровнем биосинтеза внеклеточной 5 -экзонукле. азы при культивировании глубинным способом на среде, содержащей осахаренные пшеничную муку и крахмал,соли в пределах 100 ед/мл Щ .

Целью изобретения является получение штамма актиномицета Actinomyces coeiicolor A-18, отвечающего тре-2О бованиям ферментного производства, т.е. обладающего повышенной способностью к биосинтезу 5 -экзонуклеазы.

Штамм Actinomyces coelicolor

A-18 получен s результате многократ- 25 ного рассева исходного штамма Actinomyces coelicolor A-5. Полученный штамм Actinomyces coelicolor A-18 подвергали проверке на ферментативную активность при хранении и пересевах на агаризованнай питательной среде.

Полученный штамм имеет следующие морфолагическую и физиологическую характеристики.

M о р ф о л о r и я. Твердая среда,содер- жащая осахаренные аС-амилазой пшеничную муку и растворимый крахмал, соли. Мицелий имеет вид очень тонких разветвленных гиф. Стенки клеток мицелия прямые. Ширина клеток мицелия варьирует от 0,71 до 0,93 мкм.

Спороносцы спиральные, с 1-3 завитками, нередко с примитивными спиралями, расположены моноподиально, одиночно. Споры овальные, шаровидные, с гладкой оболочкой.

К у л ь т у р а л ь í î-h и з и алогические признаки, При выращивании на твердой питательной среде колонии штамма Actinomyces coelicolor "A-18 неправильной округлой формы, поверхность бугристая, выпуклая, края неровные(рваные), . воздушный мнцелий отсутствует. Колонии частично окрашены в темно-розовый ;вет. Диаметр гигантской колонии на 10-е сутки раста 10-12 мм. Нижняя поверхность колонии гладкая, среда

767.204 не буреет, пигмент в среду не выделяется.

На агаризированной среде Чапека с

3% сахарозы рост слабый, растет тонкой, почти прозрачной пленкой. Колонии круглые, поверхность ровная, воздушный мицелий слабо развит -светло-розового цвета, диаметр колонии

6 мм.

На крахмал-аммиачной среде рост слабый, тонкой пленкой, среда не окрашена, диаметр колонии 3 мм. 10

Ha NIIA образует небольшие колонии неправильной Формы диаметром 8 мм, растет в виде тонкой морщинистой пленки, в центре колонии слегка выступающей над поверхностью гара, края 15 колонии неровные, воздушный мицелий скудный, не окрашенный, среда не бу» реет.

На сусло-агаре растет хорошо в виде мощной пленки(морщинистой)кремово- ро

ro цвета, воздушный мицелий отсутст- вует, колонии круглые, края волнистые, диаметр 15 мм. .На картофельно-пептонном агаре рост хороший, колонии в виде морщинистой пленки, окрашенный в красновато-розовый цвет, края колонии волнистые, диаметр 7 им, воздушный мицелий скудный, белого цвета.

На синтетической среде растет хорошо в виде небольших колоний(диаметр 6-7 мм),колонии гладкие, в центре слегка морщинистые, края неровные, колонии бесцветные или слегка розовые.

На ломтике моркови рост слабый в 33 месте укола; на ломтике картофеля рост слабый в верхней части столбика в виде морщинистой пленки кремового цвета.

Мясо-пептонную желатину не раэжи- 4р жает .

Молоко хорошо пептонизирует на

10-е сутки.

Нитраты не восстанавливает.

Отношение к углеводам. Крахмал гидролизует, сахара потребляет с

45 подкислением среды.

Отношение к температуре. При 20 С рост хороший, сплошной пленкой,желтого цвета, у верхнего края косяка скудный воздушный мицелий белого цве- 50 та.При ЗООС рост такой я<е, мицелий местами окрашен в красный цвет. При

37 С рост хороший в нижней части ко0 сяка в виде Морщинистой пленки. При

50 С рост отсутствует. 55

„Ф .Способ получейия Actlnomyces coelicolor A-18 состоит в подготовке материала для селекционной работы, в выделении моноконидиальных культур, $p изучении их естественной изменчивос- ти по признаку образования фермента и отбору лучших штаммов, служивших затем исходными культурами для проведения последующих экспериментов. ," <

Дальнейший этап исследования состоял в подборе питательной среды.Были проверены среды с различным содержанием пшеничной муки и растворимого крахмала,. пшеничную муку и растворимый крахмал осахаривали с4 -амилазой(0,5 го<.-амилаэы ГЗХ на 40 ки или крахмала), добавляли соли в различных концентрациях, В результате была подобрана оптимальная питательная среда следующего состава,%: мука пшеничная, прогидролизованная о(-амилазой, 2, растворимый крахмал, прогидролизованный с -амилазой, 2, сульфат аммония 0,6, мел 0,6, калий хлорйстый 0,1, агар-агар 2. Культивирование штамма Actinomyces coelicolor A-18 в глубинных условиях проводили на жидкой питательной среде того же состава, только без агара.

Рост штамма на укаэанной среде в условиях глубинного культивирования на качалке при 180 об/мин и температуре

28-30 С очень интенсивный, имеет вид густой кашеобразной массы. Макси-. мальное образование фермейта наблюдается после 72-х часов роста. Показатели общей нуклеазной активности, определяемой спектрофотометрическим методом по изменению поглощения кис- лоторастворимых продуктов распада

РНК(6 мг/мм),составляет 200 ед/мл

Фильтрата культуральной х<идкости.Показатели активности исходного штамма не превышают 100 ед/мл.

Таким образом; предлагаемый штамм

Actinomyces сое11со1ог A-18 позволяет получить внеклеточную 5 -зкзонуклеазу микробного происхождения,используемую в пищевой промышленности для улучшения вкусовых качеств продуктов и для медицины, а также для получения 5 -мононуклеотидов. Активность штамма Actinomy«s coelicolor

A-18 продуцирующего внеклеточную

5 -экзонуклеазу; по сравнению с исходным штаммом Actinomyces coelicolor

A-5 в 2-3 раза выше и составляет 200.250 ед/мл.

Пример . Для получения препа,рата 5 -экзонуклеазы штамм Actinomyces

coe1icolor А-18 выращивают при температуре 30©С при аэрации 1 объем воздуха на 1 объем среды в течение 48 ч. Активность 5 -экзонуклеазы 400 ед/мл.

Фильтруют, в полученном Фильтрате доводят рй до 5,5, добавляют MgClg в качестве стабилйзатора и осаждают фермент 2,5 объемами ацетона.

Получают препарат 5 -экзонуклеаэу

Г10Х активностью 40 тыс.ед/г. Выход препарата с 1 и -8000 г.

Использование предлагаемого штамма Actinomyces coeiicolor A-18 даст возможность получать высокоактивный внеклеточный фермент при глубинном культивировании и тем самым интенсифйцировать процесс производства.

767204

Составитель И. Привалова

Редактор Н. Спиридонова Техред H,Ãðä Корректор М. Демчик

Заказ 7 36/24 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, ".<-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП"Патент", r. Ужгород, ул. Проектная,4

Формула изобретения

Штамм Actinomyces coelicolor A,18 -продуцент 5-зкзонуклеаэы.Хранится в коллекции культурмикроорганиз,ов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции ,промышленных микроорганизмов. Регистрационный номер 9 ЦМНМ-S-464.

М о р Ф о л о г и ч е с к и е п р и з н.а к и. Твердая среда, .содержащая осахаренные -амилаэой пшеничную муку и крахмал, соли.

Мицелнй имеет вид очень тонких раз- ветвленных гиФ. Стенки клеток мицелия прямые. Ширина клеток мицелия варьирует от 0,71 до 0,93 мкм. Спороносцы спиральные, с 1-3 завитками, нередко с примитивными спиралями,рас положенными моноподиально, одиночные. Споры овальные, шаровидные, с гладкой оболочкой.

Культурально †физиологические признаки.

На твердой Питательной среде ког лонии неправильной округлой йормы, края неоовные, воздушный мицелий слабый, колонии ceooro или розовато-красноватого цвета. Диаметр гигантской колонии на 10-е сутки роста 10-12мм.

Среда не буреет, пигмент в среду не выделяется.

На агариэованной среде Чапека с

3% сахароэы рост слабый, растет тонкой, почти прозрачной пленкой. Коло:нии круглые, поверхность ровная,воздушный мицелий слабо развит - светло-розового цвета, диаметр колонии

6-7 tee.

На крахмал-аммиачной среде рост слабый, Тонкой пленкой, среда не окрашена, диаметр колонии 3-4 мм.

Иа NIA образует небольшие колонии неправильной Формы диаметром 7-8 мм, растет в виде тонкой морщинистой пленки, в центре колонии слегка выс.тупающей над поверхностью агара.Края,. колонии неровные, воздушный мицелий скудный, неокрашенный, среда не буреет.

На сусло-агаре растет хорошо в виде мощной морщинистой пленки кре5 мового цвета. Воздушный мицелий отсутствует, колонии круглые, края волнистые, диаметр 12-15 мм.

На картоФельно-пептонном агаре рост хороший, колонии в виде морщи нистой пленки, окрашенные в красно10 вато-розоватый цвет. Края колонии волнистые, диаметр 6-7 мм, воздушный мпцелий скудный, белого цвета.

На синтетической среде растет хо рошо в виде небольших колоний диаf 5 метром 6-7 мм. Колонии гладкие, в центре слегка морщинистые, края неровные, колонии .бесцветные или слегка розоватые.

На ломтике моркови рост слабый в месте укола. На ломтике картоФеля рост слабый в верхней части столбика в виде морщинистой пленки кремового цвета.

Мясо-пептонную желатину не разжижает.

Молоко хорошо пептониэирует на

10-е сутки.

Нитраты не восстанавливает .

:Оптимальная температура роста 37 С .. Рост хороший в нижней части кссяка в

30 виде морщинистой пленки.

При 50 С рост отсутствует.

Отношение к углеводам. Крахмал гидролиэует, сахара употребляет с подкнслением среды.

Зз Ак "ивность штамма Act!nomyces

coelicolor A-18 составляет 200250 ед/мл Фильтрата культуральной жидкости °

Источники инФормации, 4р принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

203837, кл. С 12 0 13/06 1966 (прототип).