Способ определения активности антибиотика-лактоцида при спиртовом брожении

Способ определения активности антибиотика-лактоцида при спиртовом брожении

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

r м.с„э ал патентно

Союз Советских

Социалистических республик

° Фл

768810

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТВЛЬСТВУ (61) Дополнительное и авт. саид-ву (22) Заявлено 130978. (21) 2663426/28-13 (51)М. Кл з

С 12 K 1/00 6 01 и 33/14 с присоединением заявим Йо (23) ПриоритетГосударственный комитет.СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 07.10.80, бюллетень М 37 (5Э) УДК 663. 541, ° 22 (088 8) Дата опубликования описания (72) Авторы изобретения

A.Ï. Рухлядева, С.П. Дементьева и М.В-, Сидорова

Всесоюзный научно-иоследовательский институт продуктов брожения (71) Заявитель (54) CHOCOS ОПРЕДЕЛЕНИЯ AKTHBHOCTH

АНТИБИОТИКА--ЛАКТОЦКДА ПРИ СПИРТОВОМ i

ВРОЗЕНИИ

1 †Изобретен относится к спиртовой промааленности, в частности к спосо бам определения аКтивиостн лактОцида, используемого в качестве актИ- .. септика при спиртовом брожении.

Антибиотик лактоцид является специфическим антисептиком молочнокислых бактерий и применяется в сйирто вой проьвааленности для подавления . 1р кислотообразукщих бактерий; угнетающих развитие дрожжей и оказывающих, ингибирукщее-действие на ферменты.

Лактоцид - антибиотик немедицинского ряда, и применение его в спиртовой промьхэленности позволяет сущест венно повысить эффективность Спиртового .брожения.

Известен способ определенйя активности антибиотика-лактоцида,. предусматривающий культивирование молочнокислых бактерий в присутствии и отсутствии лактоцида, определение степени подавления лактоцидом жизнедеятельности молочнокислых бактерий и расчет активности лактоцида 1) .

Недостатком данного способа явля« ется то, что применение его дает большой процент ошибки (50-100%), кроме того, требуетсм много времени для анализа — 24 час, Метод довольно громоздкий, необходимо большое количество проб, что создает неудобства прй 1заводском контроле.

Целью изобретения является повышение точности определения и ускорение процесса.

Это достигается тем, что в качестве молочнокислых бактерий,исполь зуют Thermobacterium cereale Lafar штамм ХП, культивирование их осуществляют на солодовой питательной среде в течение 4 час при температуре 52 С, а определение степени подавления лактоцидсм жизнедеятельности бактерий ведут по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида, с последующим расчетом активнос -" ти лактоцида по формуле: (2,7ЬЬУ З.43) 40

АкЛ ед акт/г, а где АкЛ - активность лактоцида ед/r;

V - разница в количестве гндроксида, затраченного на титрование прироста молочной кислоты в контрольной (без лактоцида) и опытной (с лактоцидсм) пробах, мп, 7 6,88 10

Питательную среду для размножения посевной бактерии готовят следующим образом: в колбы, наливают 100 мл тако-. го же фильтрата, добавляют 6 г стери льного мела и 10 г осадка, полученного при фильтровании суспенэии.

Колбы закрйвают,ватно-маулевь!Ми пробками и стерилизуют так же, как опи сано выае.

В качестве тест-организма молоч- . нокислых бактерий используют Thermobacter ium cerea1e La far штамм Х! I из музея штаммов ВНИИПрБ. The rmobac"terium cerea1.е !.айаг является предс тавителем группы Bacterium 0 el br@- 40

kiI - термофильных палочковидных бактерий, длина палочек 2,8-7,0 ммк.

Бактерии гомоферментативные, образуют кз сахара только молочную кислоту. Оптимальная температура развития бактерий 48-52 С, что является отличительным признаком культуры.

Посевную молочнокислую бактерию готовят следующим образом.

К 100 мл стерильной питательной среды с мелом и осадком добавляют в стерильных условиях 20 .мл,культуры

ТЬегпГоЬасйегium cereaIe Lafar (штамм

Х!!), затем полученную суспензкю ин-ъ кубифуют в термостате при 48-52 С в трясение 24 час, размноженную таким образом бактерию выдерживают сутки в холодильнике (4-5 С), а непосредственно перед использованием в опыте или для- пересева подогревают в термостате с температурой 48-52 С Щ в течение 1,5-2 час.

В.опытные образцы используется жидкая фаза приготовленной культуры бактЕрий, т.е.без осадка и без мела, предварительно разбавленная 65 а - количество лактоцида в тит руемой пробе, r

2,766, 3,48 и 10 - постоянные расчетные коэффициенты.

Предлагаемый Способ осуществляют следующим образом.

Питательную среду готовят следую щим образси. К 500 г размолотого яч,Менного солода в возрасте 9-10 дней ,добавляют 2 л водопроводной воды, подогретой до 50-55 С. Эту суспенэию осахаривают в водяном ультратермостате прк температуре 60-65оC в течение 1 час, затем при температуре

65"70 С еще в течение 1 час . Полученйую суспензию охлаждают до комнатной темйературы, Фильтруют через два слоя марли и в фкльтрате содержание сухих веществ доводят до 7Ъ с помощью сахариметра добавлением водопроводной воды. Такой фильтрат разливают по 25 мл в пробирки емкости 50 мп, которые закрывают ватномарлевыми пробками, и стерклйзуют в автоклаве 30 мин при 0,75 атм и используют для опытных проб. стерильной питательной средой так„ чтобы оптическая плотность разведенного в 10 раз дистиллированной водой образца данной бактерии составляла 0,650 (при определении на фотоэлектрок алориметре, при дли не в ол ны

365 нм в кювете 6= 1 мм; контроль разбавленная в 10 раэ питательная среда). Оптическую плотность используемой культуры бактерии доводят до этой постоянной величины, выбран-ной экспериментально для того, чтобы по возможности брать во нсех опытах одинаковое количество бактериальных клеток.

Приготовление раствора лактоцкда.

5 0,01%-ный водный раствор исследуемого препарата лактоцида готовят не- . посредственно перед опытом следующим .-образом: 0,1%-ный водный раствор препарата лактоцица Кипятят 5 мин на водяной бане, затем 4 раза фильтруют через бумажный складчатый фильтр и разбавляют фильтрат в 10 раэ холод- ной дистиллированной водой.

Для проведения анализа активнос5 ти испытуемого препарата берут несколько пробирок (3-5) со. стерильной пктательной средой- (без осадка и мела), добавляют в них стерильно оди-: наковое количество водного раствора лактоцида и по 2,5 мл подогретой жидкой фазы бактерии с определенной оптической плотностью (0,650 при раэбавлении 1:10) ; Затем пробирки энергич-.. но встряхивают и культивируют 4 час в термостате при 52 С.

Одновременно готовят два типа контрольных проб: контроль 1 - для определения количества гидроксида (V ), оттитров(! вающего выносимую с бактерией кислоту, контроль II — для определения количества гидроксида (V><), .оттитровывающего молочную кислоту, выделенную бактерией за 4 инкубацин ее в среде без лактоцида. для этого в такие же пробирки со стерильной питательной средой (как и для опытных образцов) заливают 2,5 мл такой же культуры бактерии (что и в опытные образцы) и стерильную дистиллированную воду в объеме, равном объему раствора лактоцида, добавленному в опытные пробы. Контроль 1 титруют сразу, контроль II — культйвнруют, как и опытные образцы, в термостате

4 час при 52 С, а затем титруют вмес6 те с опытными пробами.

Для титрования всех проб — к контрольных и опытных - отбирают из каждой пробирки 20 мл, добавляют 3- 4 капли универсального индикатора марки "PCK", титрование проводят 0,025 Я раствором гидроксида натрия (йаОН) до образования светло-зеленой окраски титруемой пробы и рН 7, 2.

Иэ полученных резу.".ьтатов титрования контроля I (Vj<) и опытных проб (Ve) вычитают У у т.е. объем щелочи, 768810 затраченный на титрование вносимой кислоты, и получают таким образом сведе .ия об объеме раствора гидроксида, затраченного на титрование прироста кислоты за 4 час культивирования с лактоцидом (Ч„,к V -Vg ) и без лактоцида (Чь/от и - Vj)

Разница Чь,,1„., - V„e„ = V покажет! объем раствора гидроксида, затраченный на титрование молочной кислоты, выделение которой подавляется заданным

I(o .ичеством лактоцида.

Активность лактоцида рассчитывают по формуле: (2,766V-Ç,48) !О ед а кт/г, где V - разница в количестве гидро- 15 ксида, затраченйого на титрование прироста молочной- кислоты в контрольной (без лактоцида) и опытной (с лакто- цидом) пробах, т.е. Ч = ;ф

Чь/„ащ - Нла,д = (Чду -Чд )- (Чо - Vj )мл; а — количество лактоцида в титруемой пробе, г; (2,766; 3,48) 10 З вЂ” постоянные коэффициенты, определенные экспериментальным путем.

tr В

За единицу активности лактоцида принято такое его количество, которое за 4 час.подавляет нарастание

1 г молочной кислоты, образующейся при культивировании молочнокислой бак- 0 терни и штамма ХII. Это количество составляет 20% ной кислоты, которая образуется при отсутствии лактоцида в стандартных условиях на солодовой среде.

Пример. Для анализа взят препарат антибиотика - лактоцида в количестве 100 мг на 1000 мл дистиллированной воды (0,01%). Приготовленный рабочий раствор содержит 4Q

0,1 мг лактоцида в 1 мл раствора.

Е пробирку с 25 мл стерильной жидкой солодовой среды для опытных проб) наливают 3 мл 0,01%-ного водного раствора лактоцида и 2,5 мл жид- 45 кой фазы посевной бактерии (общий объем 31,5 мл) — опытная проба.

Контрольные пробы: одновременно в две пробирки с такой же питательной средой наливают по 2,5 мл той же бактерии, что и в опытную пробу, и по 3 мл стерильной дистилпированной воды (вместо лактоцида) для того, чтобы общий объем был таким же, как в опытной пробе. Содержимое одной из контрольных пробирок (К I) титруют сразу, а опытную пробу и контроль !I ставят на 4 час в термостат и культивируют при 52 С, после чего охлажд дают пробирки в проточной воде и содержимое титруют. 40

Для титрования из всех пробирок отбирают пробу 20 мл, добавляют 4 капли универсального индикатора марки "РСК" и титрование проводят

0,025 н раствором гидроксида (NaOH) 65 до образования светло-зеленой окраски пробы и рН 7, 2.

Получили, что:

Vj †: 2,2 мл (на титрование К 1 израсходовано 2,2 мм NaOH), Ч1; — 20,2 мл (на титрование К !I

20,2 мл МаОН), V< — 14,2 мл (на титрование опытной пробы — 14,2 мл NaOH).

Следовательно, V = (20,2-2,2) (14,2-2,2) = 6,2 мл.

Определим количество лактоцида в титруемой пробе (а). Общий объем реакционной пробы равен 30,5 мл, в нем содержится 3 мл 0,01%-ного лактоцида, т.е. 0,3 мг, для титрования берется 20 мл из реакционной пробы.

Составим пропорцию: в 30,5 мл содержится 0,3 мг лактоцида, и в 20 млХ мг. лактоцида; получим

20 ° О,З

0,190 мг.

В

Следовательно а 0,190 10 r.

Подставив полученные величины в расчетное уравнение, получим искомую активность данного йрепарата лактоцида; (2,766.6Д - 3,48) ° 10

Axh „ 74,46|А/г

Предлагаемый способ позволяет повысить точность определения (погрешность его 128, а погрешность по известному.способу — 50-1003) и ускорить процесс определеййя с 25 час до б час. Кроме того, он менее трудоемок.

Формулу изобретения

Способ определения активности

,антибиотика - лактоцида при спиртовом брожении, пре4усматривакв!ий культивирование молочнокислых бактерий в присутствии и отаутствии лактоцида, определение;степени подавления лактоцидом заюзнедеятельности молочнокисмых бактерий и расчет активности лактоцида, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью позышения точности определения и ускорения процесса,.ь качестве молочнокислых бактерий используют Thermobacter!um cereaIå Lifer штамм XII, культивирование их осущес",ãâëÿéT на солодовой питательной среде в течение 4 часов при температуре 52 С, а определение степени подавления лактоцидом жизнедеятельности бактерий ведут по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида, с последующим расчетом активности лактоцида по формуле (2, 766 V-3,48) . 10

4кЛ=,„ 6д акТ/!, где Акл — актйвность лактоцида, ед/г;

Ч - разница в количестве гидроксида, затраченного на

Составитель Л, Пашинина

Техред И.Асталош, Корректор H. Бабинец, Редактор A. Bep

Заказ 7309/63 . ° Тирам 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретение и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, 1. Ужгород, ул. Проектная, 4 титрование прироста молочной кислоты в контрольной (без лактоцида) и опытной (с .лактоцидом) пробах, мл; а - количество лактоцида в титруемой пробе, г;

2,766; 3,48 и 10 - постоянные расчетные коэффициенты.

Источники информации принятые во внимание при экспертизе

1. Порошина Г.У. Выделение и свойства антибиотика, обладаюшего высокой антибиотической активностью в

5 отношении молочнокислых бактерий.

Микробиология, 1964, 26, вып. 6, с. 25-30.