Способ иммобилизации ферментов

Способ иммобилизации ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАЙ ИЕ

ИЗОЬРЕтЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<»>770072

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 21.05.79 (21) 2775693/23-04

51) Л! К ч з С 07 G 7/02 с присоединением заявки—

Государственный комитет

СССР по цепам изобретений и открытий (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07.01.82. Бюллетень № 1 (45) Дата опубликования описания 07.01.82

- (53) УДК 577.15.07 (088.8) (72) Авторы изобретенпя

В. Н. Борисова, N. И. Меняйлова, Л. И. Мотпна f и Л, A. Нахапетян

Всесоюзный научно-исследовательский бнотехнический институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к миз1робиологической промышленноспи, а именно к технике получения ферментов, ковалентно связанных с носителем.

Известен способ:иммобилизации ферментов,. включающий, обработку модифицированного у-аминопроаилтреэтоканаиланом крвмнеземсодержащего ноаителя сшивающим агентом и связывание фермента,с полученным носителем (1). В .качестве ащивающего агента используют диальдегиды, например глутаровый,или малоновый диальдепид, обычно в ниде 25о ного раствора.

Связывание ферментов с обработанным носителем ведут известными способами,в инертной (обычно водной) среде, при температуре и рН, не вызывающих внактнвацни фермента.

Однако глута ровый диальдегид, используемый в известном способе в качестве сшивающего агента, при х раневи и изменяет свои свойства, быстро полимеризуясь на свету,и терм действяи вещесгв основного характера; в процессе реакции тлутаровый диальдегид лолимеризуется на поверхности ам иноеремнезема, образуя продукты неустановленного строения, что с одной стороны затрудняет контроль эроцеоса модификаци и носителя и вммобилизацни фермента, а с другой стороны, дрыаодит .к снижению актив ости полученных иммобилнзованных препаратов за счет уменьшения числа aKTHBBblx функпщональных групп IHa поверхности носителя; активность полученных кммобилизованных ферментов колеблется в широмих пределах в зависимости от степени очистки и срока хранения глутарового диальдегида.

Целью, изобретения является повышен не активности иммобил изованных:ферментов, улучыение пх .качества, т. е. достижение стандартности получаемых лрепа ратов.

Указан ная цель достигается тем, что в качестве сшнвающет о агента используют и ацетали диальдегидов, а обработку и ми носителя осуществляют в врисутствии кислоты. Причем в качестве кремнеземсодержащего носителя обычно используют силохром, пор истое стекло или аиликатель, в

20 качестве ацеталей диальдегидов — тетраметил-, тет раэпил-, тепрабутилацетали глутарового или маланавозо диальдегида; п р ичем ацетали используют обычно в виде 1—

10 -ных растворов.

25 В отл.ичие от е сходных кар бонилнных соединений ацетали более устой повы к действию щелочных к окнсляющих агентов.

Также как и исходные альдегиды ацетали легко реагируют с азотистыми основаниязо ми, пап ример с аминами. Этн свойства аце77О 072

Таблица 1

Иммобилизация глюкоамилазы из Asp, niger на различных **осителях, обработанных тетраметилацеталем малонового альдегида

Количество связанного белка, мг/г

Активность иммобилизованного препарата, ед/г

Содержание

ИН, мг экв/г

Носитель

Пористое стекло МПС-1100 (порисо тость 1,2 смз/г, пор 1100 А) 0,36

20,4

96;1

Спликагель МСА-750 (пористость о

0,37 смз/г, пор 750 А) 0,4

8,3

64,3

Таблица 2

Иммобилизация глюкоамилазы из Asp. niger на различных, носителях, обработанных тетраэтилацеталем глутарового диальдегида

Активность иммобнлпзованного препарата, ед/г

Количество связанного белка, мг/г

Содержание

NH мг экв/г

Носитель

Пористое стекло МПС-1100 (порпсо тость 1,2 смз/г, пор 1100 А) 85.6

12,6

0,36

Спликагель МСА-750 (пористость

0,37 см%, пор 750 А) талей позволяют успешно проводить,иммобилизацию ферментов, дости1гать станда ртных результато в с получением .высокоактивных им мобилизованных фермен поз.

П р и.м е р 1. Иммобил изация глюкаамилазы из Asp. niger с по мощью тетраметила|цеталя малоновопо,диальдвгида.

К 1,г силохрома С-80, обработанного у-аминопропилпр иэтоксиаиланом и содержащему 0,6 мт экв а минопрупл на 1 r, прибавляют 10,мл 2% -ного |раствора тетраметилацетагля малонового диальдегида в

50% -ном водном этаноле,и 1 мл концентри|рованной соляной .кислоты, переиешввают 2 ч,,промывают спиртом, водой, К актинированному ноаителю прибавляют 10 мл распвора глюкоамилазы аз AsIp. niger c

Пример,2. Иммобилизация глюкоамилазы im Asp. niger c 1помощью тетраэтилацеталя глута рового альдепида.

К 1 т аилохрома С-80, обработанного тепраэтилацеталем глута рового диальдегида согласно при меру 1, п р|иба вляют 10 мл раствора глюкоа|м илазы,и з Asp. niger c общей активностью 200 ед:в 0,1 н ацетатном буфере (рН 4,7). Реакционную смесь перемешивают в течение 5 ч при 25 С, 0,4

П.р и м е р 3, Им мобилизация кислой протеиназы с,помощью тепрабупилацеталя глутарового диальдегида. общей активностью 200 ед в 0,1,н ацетатном буфере (рН 4,7). Реакционную смесь перемешивают п ри 25 С в течение 5 ч, после чего иммобилизованный препарат промы5 вают 1 л 1о/о-ного .РаствоРа Растворимого крахмала для удаления химически,несвязанного фермента, затем 1 л 0,1 н ацетатно го буфера (рН 4,7) и 1 л воды. Акпивность иммо билизованной глюкоа милазы

10 74,8 ед/г (определяют по глюкозооксидазной ме одике íà п рибо ре фирмы «Бекман»), количество связанного белка

18,7 вт/г. Аналогично,пр имеру 1 проводят нммоб или зацию глюкоам илазы на пори15 стои стекле МПС-1100 .и аил икагеле МСА750. Полученные данные .пр иведены в табл. 1. после чего иммобил1изованный пренарат промывают 1 л субстрата (1% -ный раствор ,растворимого,крахмала), 1 л .0,1 н ацетатното буфера (рН 4,7) и затем 1 л воды.

Активность иммобилизова нной глюкоамилазы 72 ед/г,,количество связанного белка

10,1 мт/г. Аналогично пр1кмеру 2 проводят и ммобил изацию .глюкоамилазы .на пористом стекле МПС-1100 и оиликагеле МСА750. Полученные данные приведены в табл. 2.

1 . 64,3 8,3

К 1 r силохрома С-80, обработанного тетрабутилацеталем глутарового диальдегида согласно примеру 1, прилаживают рас77О072

Таблица 3

Лктивцость иммобплизованного препарата, сд/г

Колпясство связанного белка (мг/г

1 !

Содержание дтН мг экв/г

1-1осптель

11.6

0,36

45,6

7,8

42,3

0,4 тво р ферментного препарата (лротоавамо,рин Г25х) с общей активностью 132 едПС и содержа1нием белка 120 мг в 0,1 N универсальном буфере (рН 4,1). Реакционную смесь:инкубируют в течение 3 ч при 5 С и перемешивали и. По окончанки:реакции иммобил1изованный;препарат отмывают на фильтре 1 л 1воды, 1М раство1ром хлористого НВТ!рН!Н и опять .водой до пол1ного отсутствия белка в промьгвных водах. Активяость иммобилизованной иислой протеиназы 132 едПС/г, содержание белка 30 мт/г. (Протеол итическую активность нативного и .иммобил изованного препаратов,кислой протеиназы определяют по казеинату натрия модифици,рованны:м методом Ансона) .

Аналогично описанию примера 3 проведена иммоб|илизация ки1слай протеиназы;на

:оилохроме С-80 с помощью тетраметилацеталя .малонового д иальдепида. AKTIHBIHocTb им мобилизованной кислой протемн азы

144 ед/г, .количество связанного белка

30 мг/г.

П р,и м ер 4. Им мобилизация нейтральной протеиназы с помощью тетраметилацеталя малонового диальдегида.

К 1 г оилохро ма С-80, обработанному тетрамет илацеталем малонового диальдегида согласно примеру 1, приливают |раствор нейт р алиной протеиназы (п1ротосубтилнн

ГЗх) c,oáùåé акт1ивностью 110 едПС,и содержанием белка 50 мг в 0,1М универсальном буфере (рН 7,0): Реакционную смесь и нкубируют в течение 3 ч прои 5 С и непрерывном пе ремешивавии. По окончании,реакции .иммобилизованный nlpenBpBT отмывают 1 л eogbI, 1,0М 1раствором хлористоIo,HBòðèÿ и о пять вод ой до полного отсутствия белка в промы|вных водах. Активность иммо билизова нной нейтральной Dpoтеиназы 14,3 едПС/г, содержание белка

14,0 иг/г.

Аналогично прои меру 4 проводят,иммобилизацию нейтральной протеиназы с помощью тет раэтилацеталя глутарового диальдегида. Активность иммобилизованной нейтральной .протеиназы 6,0 едПС/г, количество связанного белка 9,5 мг/г.

Пористое стекло Мг1С-1100 (порпстость 1,2 с ..Р/г. пор 1!00 Л) Спликагсль ЧСЛ-760 (порпстость о

0,37 смз/г, пор 750 Л) П.р и и е р 5. Иммобилизация инвертазы с помощью тетраэтилацеталя глутарового диальдегида.

К 1 г аилохрома С-80, обработа|нного тетраэтилацеталем;глутаровото диальдегида сотласно п|римеру 1, прогиба.вляют 10 .мл раствора дрожжевой .и нвертазы с общей активностью 2000 ед в 0,1М ацетатном буфере (рН 4,7). Реакционную смесь переме10 шивают в течение 6 ч inри 25 С, после чего иммобилизованный преларат промывают

1 л 1М 1раствора хлористого, натрия и затем

1 л воды. AKTinjiBHocTb,èììoáèëèçoâBHHoé

jmHjaep Taabl 1050 ед/г, количество овязанно10о белка 12 мг/г. (АктиBHGcTb нативного IH |иммобнлизованнаго препаратов кнве ртазы определяют .глюкозооксидазным .методом .на .приборе фирмы «Бекман»).

П,р и м е р 6. (Контроль) Иммобилизаы ция глюкоамилазы IHi3 Asp. nlgel с помощью тлутарового диальдепида.

К 1 г силохрома С-80, обработанного уаминолропилтриэтоксисила ном и содержащего 0,6 мг - экв аминогрулп на 1 т носи25 теля, п рибавляют 2% -ный распвор глута:,рового диальдегида фи рмы «Реанал» в

0,5М фасфатном буфере (pH 7,0) и перемеш ивают при 25 С в течение 1 ч, затем ноаитель промывают 2 л воды для удале30 ния непрореагировав шего глута рового диальдегида и к носителю приливают 10 мл раствора глюкоамилазы из Asp. niger 1в

0,1М ацетатном буфер е (рН 4,7) с общей активностью 200 ед. Реакцию связываняя

36 глюкоамилазы с,носнтелвм продолжают в течение 3 ч при 25 С при постоянном перемешиван1ии, по окончании реакции иммобилизованный фермент промывают 1 л 1%наго раствора растворимого крахмала для удаления нековалентно связанного белка, 1 л 0,1М ацетатного буфера (ipH 4,7) и 1 л воды. Активность иммобил1изованного п|репарата 40,4 ед/г, количество связанно го белка 9,3 мт/г.

46 Аналопично примеру 6 проведена пммобилизация глюкоаиилазы !НВ пористом стекле МПС-1100 и силпкагеле NCA-750.

Полученные данные представлены в табл. 3.

77i0072

Формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Техред И. Заболотнова Корректор И. Осиповская

Редактор П. Горькова

Заказ 28/38 Изд. № 108 Тираж 389 Подписное

НПО <Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»

Пример 7 (контроль). Им1мобил изация нейтральной протеиназы с помощью глутарового диальдегида.

К 1 г оилохрома С-80, OI6pаботанному у-аминоп роп илтриэтоксисилàHOiM и содержащему 0,6 imr экв ам ино групп |на 1 т носителя прибавляют 2%- ный распвор глута рового диальдепида согласно примеру 6, прибавляют раствор:нейтральной,п ротен назы с общей а ктивностью 110 ед и содержанием белка 50 мг в 0,1М универсальном буфере рН 7,0. Дальнейшую обработку проводят согласно примеру 4. Получают препарат иммобилизоваяной аротеи назы с активностью 3 едПС/г и содержанием связанного белка 6,0 мг/г.

Пример 8. (Контроль). Иммобилизация кислой протелназы с помощью глутарового диальдегнда.

К 1,r оилохрома С-80 с содержа.нием ами ногрупп 0,6 мг экв/г, обработанного

2%-ным раствором глутарового диальдегида согласно примеру 6, прибавляют !раствор,кислой п ротеиназы ic,общей активностью 132 ед и содержанием белка 1.20 мг в 0,1М универсальном буфере (рН 4,1).

Дальнейшую обрабопку проводят согласно примеру 3. Активность, полученного препарата иммобилизованной кислой протеиназы

29 едПС/г,:,количество связа ниого бел.ка

32 мг/г.

Hip и м е,р 9 (конпроль). НММо.б илизащия дрожжевой инвертазы с помощью глутарового диальдепида.

К 1 r силохрома С-80, обработан ного

2%-ным раствором глутарового альдепида согласно |примеру 6, прибавляют 10 мл ipacтвора инвертазы iñ общей активностью

2000 ед в 0,1М ацетатном буфере (рН 6,5).

Реакцию связывания ;инвертазы с носителем:продолжают 6 ч л ри 25 С при перемеш ивании. По окончании реакции iHMmoбилизованный фермент промывают 1 л 1М раствора хлористого натрия для удален|ия нековаленпно связанного фермента:и 1 л воды. Активность иммобилизованнопо препа рата 760 ед/г, количество связанного бел-ка 9,8 мт/г.

Таким образом описываемый способ иммобилHIBBIIHIH ферментов с lIIOìîùüþ ацета5 лей диальдегидов да ет возможность получать препараты и м мобилизованных фер-ментов, активность,кото рых выше, чем активность ферментов, иммобилизова нных с помощью д иальдепидов,,например глута р о1р во го диальдетида (например для глюкоамилазы,в случае силохрома С-80 активБость выше íà 46%, пориспого стекла МПС

1100 — 53%-, силикагеля МСА-750 —,на 39%).

К роие пого при нммобилизации с помо15 щью ацеталей диальдепидов получают стандартные по акпивности препараты.

1. Способ кимобилизап1ии ферментов пу-тем обработки модифицированного у-аминоцропилтриэтоксисиланом кремнеземоодержащего,нос|ителя сшивающим |реагентом с последующим связьгванием фермента, отл и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения активности и улучшения качества целевого продукта, в качестве сшивающего агента используют ацетали диальдегидов, а обработку,им и носителя осу-30 ществляют в присутствии кислоты.

2. Способ по,п. 1, отлич а ющи и ся тем, что в качестве креынеземсодержащего носителя используют силомером, или пористое стекло, или оиликапель.

35 3. Способ по л. 1, отлич ающийся тем, что ацетал и диальдепидов используют в аиде 1 — 10%-ных tpacmop.a.

4. Способ по пп. 1 ы 2, о т л и ч а ю щи йс я тем, что в .качестве ацеталей диальдепи-40 дов используют тет раметил-, тепраэтил-, тетрабутилацетали глутарового или малонового диальдегида.

Источник иноформации, принятый во:

45 внимание при экспертизе:

1. Патент США № 3669841, кл. 195-63,. апублик. 1972 (прототип).