Способ определения мутагенной активности физических факторов

Способ определения мутагенной активности физических факторов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

E О П

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Cees Советских

< >770!88

Социалистических

Реслублик (61) Дополнительное к авт. свид-By— (22) Заявлено 24.01.79 (21) 2719499/30-15 (51) М.Кл.з С 12 К 1/02 с присоединением заявки— (23) Приоритет—

Хосударстеенный комитет ио делам изобретений н открытий (43) Опубликовано 07.01.82. Бюллетень № 1 (53) УДК 575.24 (088.8) (45) Дата опубликования описания 07.01.82 (72) Авторы изобретения

H. А. Троицкий и С, Е. Дромашко (71) Заявитель Институт генетики и цитологии АН Белорусской ССР (54) СПОСОБ ОП P ЕДЕЛ ЕНИЯ

МУТАГЕННОИ АКТИВНОСТИ

ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Изобретение относится к области методов и принципов оценки мутагенной активности физических факторов среды с помощью микробиологических исследований и может быть использовано для оценки повреждающих генетический аппарат факторов анешней среды с целью обнаружения потенциальных генетических опасностей и охраны живых организмов.

Как известно основная опасность повышающегося уровня загрязнения окружающей среды заключается в воздействии на генетический аппарат клеток — мутагенном действии.

Мутагенное действие физических факторов внешней среды на живые организмы проявляется как в мутациях (имеются в виду точковые мутации) — изменении генетического аппарата клеток путем нарушений в отдельных основаниях ДНК, так и в генетических рекомбинациях — изменениях генетического аппарата путем перемещения отдельных участков ДНК. В свою очередь генетическая рекомбинация сопровождается мутациями вследствие конверсии генов при коррекции молекулярных гетерозигот.

Известен способ определения мутагенной активности физических факторов путем скрещивания исходных форм бактерий

Е. cali, из которых реципиентная форма обработана физическкм фактором, а донорская — интактна, выделения рекомбинантных бактерий и определения частоты рекомбинантов по тестируемому гену, по которому судят о мутагенной активности физического фактора 11).

Однако этот способ не позволяет выделить и учесть первичные рекомбиногенные повреждения в ДНК вследствие того, что подвергая мутагенному воздействию физическим фактором реципиентные бактерии, в которых при последующем скрещивании их с донорскими бактериями осуществляет15 ся процесс рекомбинации, при определении частоты учитывают не только первичные рекомбиногенные повреждения в ДНК, но также и повреждения ДНК, возникающие за счет воздействия на цитоплазму клеток

20 и их ферментные системы. С другой стороны, этот способ не позволяет обнаружить часть повреждений ДНК вследствие их репарации.

Целью изобретения является, раннее вы25 явление мутагенной активности физического фактора путем учета первичных рекомбиногенных повреждений ДНК.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения мутагенной активз0 ности физических факторов путем скрещи770188

Таблица 1

Частота проксимальных неселективных маркеров (%) в рекомбинантах Arg+Str, полученных при облучении донора HfrC нейтронами

pro (leu

Воздействия

tac

thr

55,8 63,0

53.,2 52, 0 49,7 51,2

521 466

453

53,0

52Il

51,7

65,0

55,4

54,0

51,0

Таблица 2

Частоты проксимальных и дистальных маркеров (%) в рекомбинантах His+Trp + и Pro+ Trp+, .полученных при облучении донора HfrC y-лучами

Воздействия

his

thr teu

arg

pro

63,2

50,7 !

3,1

4 1, 1

8,6 .27,4

l2,6

Контроль

rtosa 5 крад

Доза 20 крад

63,6 ,33,9

54,0

26,7

39,6

;14,9 0,3

0,2

58,1

43,6 вания исходных форм бактерий Е. coli, одна из которых обработана физическим фактором, выделения рекомбинантных бактерий и определения частоты рекомбинантов по тестируемому гену, по которому судят о мутагенной активности физического фактора, в качестве исходной формы бактерий для обработки физически м фактором используют донорские бактерии Е. coli, а в качестве интактной — реципиентные бактерии Е. cali.

Предложенный способ позволяет при воздействии физическим фактором in vivo (на клетку) количественно охарактеризовать повреждения ДНК, ведущие к рекомбинации, и учесть переносимые повреждения, не подвергшиеся действию репаращиснных систем в донорской клетке.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. В качестве тест объекта для воздействия мутагенным фактором используются штаммы Е. coli К-12 HfrC u

АВ 1157 F —. В качестве примера физического фактора используются у-лучи и нейтроны (могут быть использованы различные физические факторы).

Донорские бактерии Е. coli обрабатывают физическим фактором, после чего скрещивают с интактными реципиентными бактериями Е, coli. Затем выделяют рекомбинанты, которые методом реплик пересевают на чашки для получения неселективных маркеров по тестируемому гену, и производят подсчет рекомбинантов. Оценку мутагенной активности физического фактора производят на основе математичеКонтроль

1-lейтроиы 1 МэВ, доза 0,6 крад

Нейтроны 0,2 МэВ, доза 0,03 крад

1-(ейтроиы 0,2 МэВ, доза 0,09 крад ской модели рекомбинации, дающей связь между частотами:неселектовных маркеров и параметрами, ха1рактер изую щими рекомбинацию.

Пример. На мембранные фильтры наносят по — 0,5 10 донорских клеток Е. coli

Н1гС в логарифмической фазе. Облучение нейтронами производят в дозах 0,6 крад (быстрые нейтроны) и 0,03 и 0,09 крад (промежуточные нейтроны) на горизонтальных каналах ядерного реактора АН БССР, оборудованных фильтрами для получения нейтронов с соответствующими энергиями. Облучение 1-лучами "Cs проводят в дозах 5 и 20 крад. Затем на фильтры с облученными клетками наносят по 0,5 . 10 реципиентных клеток E. coli АВ 1157 F — и инкубируют на поверхности твердой среды для скрещивания в течение 90 мин при 37 С.

Через 48ч на селективной среде отбирают рекомбинанты Arg+ Str или His+ Тгр+, Pro Тгр+, которые методом реплик пересевают на чашки для получения неселективных маркеров lac+ arg+, рго+ arg+, 1eu+ arg+, thr+ arg+ или рго+ his+, thr+ leu+ his+, arg+ his+, рго"- thr+ leu+, pro+ arg+. Через 12 — 14 ч производят подсчет таких рекомбинантов.

В табл. 1 и 2 приведены частоты про30 ксимальных неселекти вных ма р1керов в рекомбинантах Агg-Str+, полученных при облучении донора HfrC нейтронам и, и п роксимальных и дисталь ных неселекгивных .маркеров в .рекомбинантах His+ Тгр+ и

35 Рго+ Тгр+, полученных .при облучении донор а H fr(у-луча ми.

770188

Оценку активности мутагена проводили на основе математической модели рекомбинации:

P 1 t (fr т/

/7,.

1/

fr mr г — fr+ mr)(— 4) e — т/(-» — 4) Fd где F„

F„

Vry

vmr

V mt

Параметры рекомбинации в контро

Нейтроны 0,2 МэВ

Нейтроны

1 МэВ, доза

06 крад

Параметры

Контроль доза 0,09 крад доза 0,03 крад

68,6 1,9 I 76.8 /6,9

1 283 + - 97 I 518,9 38,7

0 085 /-0 008 0 092 +-О 009

1,43+0,03:0,56 +.0,05

Рр, % ср, у6 крал — 1 мин — 1, — 1

"mr мин крад

30,1» 5,6

67,4-+ 4,2

62,1+ 11,7

0,084 ь-0,009

0,070» 0,007

0,042 -0,008

Таблица 4

Параметры рекомбинации в контроле и при облучении у-лучами

«-облучение доза 5 крад доза 20 крад

Контроль

Параметры — . — 1 с,„1, мин крад

, 0,0044+-0,0021 0,0038 0,0010 частота проксимальных неселективных маркеров; частота дистальных неселективных маркеров; вероятность интеграции в рекомбинант начала донорской хромосомы;

10 вероятность рекомбинации отцовских генов; вероятность рекомбинации материнских генов; вероятность прерывания реком- 15 бинации;

Как следует из табл. 3 и 4 облучение вызывает увеличение частоты интеграции начала донорской хромосомы (Ро) и частоты рекомбинации (V,) — последнее явление происходит за счет включения в рекомбинант более коротких, чем в контроле фрагментов отцовской хромосомы.

Предложенный способ позволяет с высокой чувствительностью определять рекомбиногенную эффективность физических факторов внешней среды.

1 — местоположение дистального селективного гена;

4 — местоположение проксимального селективного гена.

Обработку результатов производят на

3ВМ «Мир-1» по программам, разработанным на основе метода наименьших квадратов. При расчетах учитывается, что в контроле параметры v и vf, равны, а при облучении меняется только коэффициент

Результаты расчета параметров рекомбинации Р„, v „ mt, а также их приращений ар, о, и о, на единицу дозы приведены в табл. 3 и 4.

Таблица 3 ле и нри облучении нейтронами

Положительный эффект. Позволяет увеличить чувствительность при определении мутагенного действия на бактерии. Для примера сравнивают чувствительность предлагаемого способа и метода обратных мутаций.

По данным Бриджеса и Мансона вероятность мутирования в расчсте на одну хромосому бактерий при облучении 1/-лучами составляет б 10 —" рад — или б . 10 — з крад —, и для я-лучей с энергией

770188

Формула изобретения

Техред И. Заболотнова Корректор И. Осиновскаи

Редактор П. Горькова

Заказ 28/38 Изд. № 108 Тираж 504 Подписное

НГ10 «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»

3 МэВ 1,12 10 —" рад - или 1;12Х

X10 — крад . Предлагаемый способ показывает чувствительность при облучении у-лучами для вероятности рекомбинации (о,) 3,6 . 10 — крад — на 1 мин хромосомной карты или — 3,6 . 10 — крад для всей хромосомы, т. е. чувствительность предлагаемого метода на 7 порядков выше, чем метода обратных мутаций.

Предлагаемый способ особенно чувствителен при определении повреждений ДНК плотноионизирующими излучениями. В данном случае регистрируется каждое попада ние часаицы в бактериальную:клетку за исключением сравнительно редких случаев прямого .попадания в оуклеаид. Чувствительность метода обратных мутаций для плотноионизирующей радиации по данным

Б риджвса и Мансона 1ирайне мала. Вероятность мутации на одну бактериальную хромосому составляет, например, для а-лучей с энергией 3 МэВ 1,12 10 — крад — . Данные по рекомбиногенному действию, измеренные предлагаемым способом, могут быть экстраполированы на эукариотические организмы. Коэффициенты относительной генетической эффективности нейтронов различных энергий, измеренные предлагаемым способом, близки по абсолютной величине к соответствующим значениям для частот хроматидных аберраций в лимфоцитах человека и для хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей.

Способ определения мутагенной активности физических факторов путем скрещи10 вания исходных форм бактерий E. coli, одна из которых обработана физическим фактором, выделения рекомбинантных бактерий и определения частоты рекомбинантов по тестируемому гену, по которому су-!

5 дят о мутагенной активности физического фактора, отличающийся тем, что, с целью раннего выявления мутагенной активности физического фактора путем учета первичных рекомбиногенных повреждений

20 ДНК, в качестве исходной формы бактерий для обработки физическим фактором используют донорские бактерии Е. coli, а в качестве интактной — реципиентные бактерии Е. cali.

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

1. Wood Т. Н., Walmsley R. Н. Biophys.

J., 1969, 9, 391.