Способ культивирования вирусов

Способ культивирования вирусов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

т:.Нтнт - .ОпиСАН

Союз Советских

Социалистических

Республик

770195

kj ф»

D // г

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) ЗаЯвлено 19. 0 2. 7 9 (21) 2 7 2 7 58 3/2 8-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет—

Опубликовано <507.81. бюллетень № 26

Дата опубликования описания 1507.81 (51)Щ, Кд.з

С 12 N 7/00//

С 12 и 7/00

С 12 R 1/91 осударствеииый комитет

СССР ао делам изобретеиий и открытий (53) УДК 576. 8. 093. .35(088.8) (72) Авторы изобретения

Л.Л.Миронова, В.П.Грачев, Н.В.Кузнецова и В.Д.Попова

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

ANH СССР (71) За яв ит ель (54 ) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ

Изобретение относится к вирусоло гии.

Известен способ культивирования вирусов Путем размножения на линии перевиваемых клеток почки обезьяны

Г13.Недостатком известного спосбба является отсутсвие стандартных свойств отдельных клеток, поддержива- 1р емых в разных лабораториях мира, а также контаминация посторонними агентами. Кроме того, в нем используется дифицитная эмбриональная сыворотка.

Цель изобретения — упростить способ. .Эта цель достигается тем, что вирусы размножают на линии перевиваемых клеток почки взрослой зеленой мартышки 4647. 20

Полученная линия клеток почек взрослой зеленой мартышки 4647 имеет следующие морфологические и биологические свойства.

Культура представлена округлыми эпителиоподобными клетками, цитоплазыа не вакуолизирована, ядро срдержит мелкозернистый гетерохроматии и 12 ядрышка.

Клетки линии 4647 образуют монослой на вторые сутки после субкультивирования, причем монослой удается получать даже при внесений в 1,5-литровую матрасную колбу 4 10о клеток, Время удвоения популяции составляет

24 ч. Коэффициент развивки достигает величин 1:2, 1:3. для пассирова« ния клеток используют смесь основной среды Игла с 0,5%-ным гидролизатом лактальбумина и 5-10% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки линии 4647 сохраняются в жидком азоте более двух лет без снижения пролиферативной активности, способны длительное время оставаться на стекле без субкультивирования и смены среды, а также выдерживать в течение

21 дня агаровое покрытие с аминопептидом и бикарбонатом натрия.

Клетки линии 4647 чувствительньФ к различным вирусам: вакцинному штамму вируса чумы плотоядных, вакцинным штаммам вируса полиомиелита, пенящим вирусам, а также к цитомегаловирусу обезьян.

Пример 1. Способ культивирования вируса чумы плотоядных ", В 1,5-литровую матрасную колбу с перевиваемыми клетками почек взрослой

770195, зеленой мартышки 4647 на уровне 47 .пассажа вводят 0,25%-ный раствор трипсина, подогретый до 37оС. Через

30 с трипсин удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37оС на 3 мин. Затем оставшиеся клетки ресуспендируют в среде роста - смесь

0,5Ъ-ного гидролизата лактальбумина; на растворе Хенкса со средой Игла в равных количествах и 10Ъ сыворотки крупного рогатого скота.Взвесь разли-вают на две матрасные колбы. Эти культуры на уровне 48 пассажа инкубируют при 37 С в течение 2 суток до момента формирования сплошного слоя.

При заражении вирусом среду сливают из культуральных сосудов, клетки однократно промывают раствором Эрла и в каждую матрасную колбу вводят по 10 мл жидкости, содержащей 3,39

БОЕ/мл вируса. Для адсорбции вируса культуры выдерживают при 34 С в течении 1 ч при постоянном покачивании, после чего добавляют поддерживающую среду — смесь 0,5Ъ-ного гидролиэата локтальбутина на растворе

Эрла со средой Игла в равных количествах и 5% аминопептида. Инфицированные культуры инкубируют при 34оС.

На пятые сутки поддерживающую среду удаляют и в сосуды наливают новые порции среды того же состава. Сбор вируса проводят на 8 день после заражения и определяют его титр по методу образования бляшек. Титр равен 5,3 1g БОЕ/мл.

При культивировании вируса q,первичной культуре клеток почек обезьян титр вируса достигает 4,0 1g BOE/ìë.

Пример 2. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм.

Сэбина" 1 типа.

Клетки перевиваемой линии 4647 получают и готовят к заражению по описанному в примере 1 способу.

При заражении вирусом полиомиелита, штамм"Сэбина" 1 типа, среду иэ культуральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и вводят вирусодержащую жидкость иэ расчета 3 BOE на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качестве которой используют смесь 0,5%-ного гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса со средой Игла в равных количествах.

Инфицированные культуры инкубируют при 34с С. Сбор вируса производят на четвертый день после заражения и определяют его титр по методу образования бляшек. Титр составляет

7,5 1g BOE/ìë.

При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян получаются аналогичные результаты.

Пример 3. Способ культивирования пенящего вируса обезьян.

Клетки линии 4647 на уровне 45 пассажа определяют от стекла по методу, описанному в примере 1, и эксплантируют в литровую роллерную бутыль в количестве 60х10 клеток. Культуру инкубируют при 37 С во вращающемся состоянии со скоростью 18 об/ч в течение 24 ч до момента формирования монослоя. При заражении вирусом: среду иэ культуральных сосудов слива-. ют, клетки промывают физиологическим раствором и вводят вирус из расчета

10 ТЦД /мл в объеме 30 мл поддерЬ живающей среды. Вращательным движением вируссодержащую жидкость равномерно распределяют по монослою.Адсорбцию вируса проводят при 37оС в течение 1 ч при постоянном вращении

Затем вирусодержащую жидкость удаляют, а в сосуд вводят 100 мл поддерживающей среды с 1% сыворотки телят.

Культуральные сосуды помещают в барабан и вращают с той же скоростью при 37 С в течение 4 дней. После этого проводят сбор вируса с последующим титрованием по развитию цитопатического эффекта. Титр вируса составляет 10 ТЦП /мл.

Параллельно этйм вирусам.заражают культуру клеток почек обезьян в матрасной колбе, находящейся в стационарном положении. В ней вирус размножается до титра 10 ТЦД /мл.

Для получения антигена к пенящему вирусу клеточный пласт снимают замораживанием в смеси спирта с сухим:льдом. Разрушенные клетки осаждают центрифугированием в течение

15 MHH при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве антигена и сохраняют при температуре -10оС. "Нормальный" антиген из незараженных клеток 4647 получают в аналогичных условиях.

Перед использованием в РСК антигены предварительно проверяют на антикомплементарную специфичность.и антигенную активность.

Предлагаемый способ позволяет расширить виды клеточных субстратов, используемых для культивирования вирусов. Применение перевиваемой линии клеток почек взрослой зеленой мартышки 4647 приводит к уменьшению экономических затрат для культивирования вирусов в связи с тем, что может заменить дорогостоящие первичные клетки почек обезьян. Кроме того клетки линии 4647 обладают стандартными биологическими и морфологическими свойствами, не содержат мико-. плазм, имеют высокую пролиферативную активность, легко культивируются на отечественных средах и сыворотках, не теряют своих свойств при хранении в жидком азоте и имеются в запасе.

Использование для культивирования вирусов клеток линии .4647 расширит

770195

Формула изобретения

Составитель С.йаяютина

Редактор М.Кузнецова Техред С. Мигунова Корректор В.Бутяга

Заказ 5757/38 Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035,Москва,М(-35,Раушская наб.,д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 возможности успешной диагностики вирусных инфекций, позволит получать в значительных количествах антигены пенящего вируса и цитомегаловируса обезьян, приготавливать вакцины для ветеринарной практики.

Способ культивирования вирусов путем размножения на линии перевиваемых клеток почки обезьян, о т л и— ч а ю шийся тем, что с целью упрощения способа, вирусы размножают на линии перевиваемых клеток почки взрослой зеленой мартышки 4647.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Hopps H.Е.at.al. Biological

characteristics of a serlal1i cultivated kidney cells derived from the

african green monkey, Cercoplthecus

aethiops. Fediration Proceedings, 1962, 21,454.