Способ выделения гексокиназы из пекарских дрожжей

Способ выделения гексокиназы из пекарских дрожжей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

<„>771112

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву— (22) Заявлено 091178 (21) 2681634/23-04 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 151080, Бюллетень Но

<511 М. Кл.

С 07 G 7/02

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15..07(088.8) Дата опубликования описания 151080

И. А. Алишевичене Г. -К. К. Купятис, И. -Г. И. Песлякас, В.С.Веса и A -С.А.Глемжа (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕКСОКИНАЗЫ ИЗ ПЕКАРСКИХ

ДРОЖЖЕЙ

Изобретение относится к области энзимологии и предназначается для создания препаративного способа выделения дрожжевой гексокиназы, используемой в качестве важного аналитического реактива .для определения содержания аденозинтрифосфата, глюкозы и других гексоз в биологических жидкостях в медицинской и научной практике.

Известные до настоящего времени способы выделения и очистки гексокиназы включают ряд стадий классического выделения и очистки фермента.

При этом многостадийность процесса выделения фермента нежелательно сказывается на его выходе, а сам процесс является трудоемким, требующим длительного времени.

Известен способ выделения дрожжевой гексокиназы путем биоаффинной хроматографии с использованием сорбента, полученного на основе агарозы и производного никотинамидадениндинуклеотида. Однако данный тип сорбента является непригодным для препаративного выделения гексокиназы иэ-за дороговизны, сложности его получения и низкой стабильности в процессе использования Г1) .

Известен также способ выделения дрожжевой гексокиназы, включающий стадии автолиза высушенных пекарских дрожжей в 0,2М NapP04 в течение

2 ч, центрифугирования и ингибирования дрожжевых протеаз фенилметилсульфофторидом, их отделения, кислотного фракционирования при рН 4,4 с последующим двухкратным фракциони10 рованием сульфатом аммония нри степенях насыщения 40 и 55% и диализа ферментного раствора против ацетатного (pH 4,4) и сукцинатного (рН 6,0) буферных раствОров в течение 100 ч, (2J, Однако данный способ выделения гексокиназы обладает рядом существенных недостатков:

-Процесс выделения целевого фермента является многостадийным, включающим многократные операции центрифугирования и продолжительного диализа. Технологически при выделении препаративных количеств фермента данные методические приемы, особенно диализ, являются крайне

-неудобными и трудноосуществимыми на практике;

Степень очистки выделенного фермента поставляет всего лишь 5 раэ

3Q при низком выходе (30-35%) активного

771112 фермента уже на начальных стадиях его выделения, что обуславливает крайне низкий выход фермента на последующих стадиях его доочистки.

Целью изобретения является повышение выхода фермента и сокращечие процесса его выделения.

Поставленная цель достигается описываемым способом получения гексокинаэы из пекарских дрожжей, включающим автолиз высушенных дрожжей в 0,2M NagHPO< s отделение автолизата, ингибирование протеаз в автолизате обработкой фенилметилсульфофторидом и их отделение, хроматографию полученного в результате автолиэата в Na-фосфатном буфере рН 7,0-15

7,5 на сорбенте,представляющем собой аминоэтилцеллюлоэу,модифицированную

В-D-глюкозой в степени 50-70% от начальной концентрации аминогрупп, с последующей десорбцией фермента 20 градиентом NaC1 в концентрации 0,051,0 М в исходном буфере.

Существенными отличиями,описываемого способа являются осуществление хроматографии автолизата после от- д деления протеаз в буферном растворе фосфата натрия рН 7,0-7,5 с десорбцией фермента градиентом NaCl в концентрации 0,05-1,0 М в исходном буфере, а также использование в качестве сорбента аминоэтилцеллюлозы, модифицированной В-0-глюкозой в степени 50-70% от начальной концентрации аминогрупп.

Описываемый способ выделения дрожжевой гексокиназы обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества: повышение в 2-3 раза выхода активного фермента, что приводит K снижению себестоимости целевого про- 4О дукта, двукратное повышение удельной активности выделяемого фермента, что привоцит к снижению затрат на дальнейш е стадии доочистки Фермента. сокращение времени процесса выделения фермента в два раза, что важно при получении препаративных количеств ферментов в промышленных масштабах. 50

Преимуществом описываемого способа является также то, что исключаются те стадии очистки фермента, которые обуславливают низкий выход фермента, так как по своей сущности они действуют на нативную структуру фермента, разрушая его.

Пример 1. Способ выделения дрожжевой гексокинаэы.

Пекарские дрожжи измельчают, высушивают в течение 14 сут, при комнатной температуре. 1,87 г высушенных дрожжей суспендируют в 5,6 мл

0,2 М Na HP04 и автолиэируют при

37ОC в течение 2 ч. Полученный экст ракт центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин и ингибируют протеазы прибавлением. 0,09 мл 0,04 M раствора фенилметилсульфофторида в

96%-ном этиловом спирте. Полученный экстракт подогревают до 25С С и оставляют при этой температуре на 30 мин.

Диализ экстракта проводят против

0,005М натрийфосфатного буфера рН

7,5 в течение 36 ч. Концентрация белка 25 мг/мл, удельная активность

3 ед/мг.

5 г сорбента загружают в хроматографическую колонку (1,5х20 см), уравновешивают 0,005 М натрийфосфатным буфером рН 7,5 и наносят 6,0 мл полученного ферментногo раствора.

Концентрация белка 25 мг/мл, удельная активность 3 ед/мг; При элюции

200 мл исходного буферного раствора рН 7,5 вымываются балластные белки и красящие вещества. Элюирование гексокиназы проводят градиентом хлористого натрия от 0,05-1М в том же буфере, рН 7,5. Удельная активность гексокиназы после элюции 38 ед/мг.

Выход по активности не ниже 70Ъ.

Пример 2. Получение сорбента.

5 r аминоэтилцеллюлозы Ту-10Н117-67 производства Олайнского завода химических реактивов, аналитической емкостью 0,26-0,45 мг-экв/г суспендируют в 1000 мл дистиллированной воды и через 30 мин жидкость с неосевшими мелкими частицами сливают. Процедуру повторяют 4-5 раэ. Затем влажную массу суспендируют в 1000 мл 0,3 M раствора гидроокиси натрия. Через 1 ч жидкость с неосевшими частицами сливают, B дальнейшем декантируют водой до нейтральной реакции по лакмусу.

Отмытую аминоэтилцеллюлозу суспендируют в 250 мл воды и переносят в трехгорлую круглодонную колбу емкостью 500 мл, снабженную механической мешалкой и обратным холодильником.

Добавляют 0,25 r хлористого цинка и 5 г В-D-глюкозы и кипятят при перемешивании в течение 7 ч. Затем реакционную массу охлаждают до комнатной температуры, переносят содержимое колбы в однолитровый стакан, и непрореагированную глюкозу и хлористый цинк иэ сорбента удаляют декантацией с водой. Полученный сорбент хранят во влажном состоянии залитым водой в холодильнике при 4ОC.

Формула изобретения

Способ выделения гексокинаэы из пекарских дрожжей, включающий автолиэ высушенных дрожжей в 0,2 M

Na>HPQ, отделение автолиэата,ингибирование протеаз в автолизате обработкой фенилметилсульфофторидом и их отделение, о.,т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и сокращения про771112

Составитель О. Скородумова

Редактор Л. Емельянова Техред Е. Гаврилешко Корректор И. Муска

Заказ 7394/34 Тираж 495 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4f5

Филиал ЧПГ! "Натент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 цесса его выделения, полученный после отделения протеаз автолизат подвергают хроматографии в Na-фосфатном буфере рН 7,0-7,5 на сорбенте — аминоэтилцеллюлозе> модифицированной 8-D-глюкозой в степени

50-70% от начальной концентрации аминогрупп, с десорбцией фермента градиентом NaC1 в концентрации

0,05-1,0 M в исходном буфере.

Источники информации, принятые во внимание при зкспертизе

1. С.У.Lee, 1 . Н.Lajarus, 0.S.Kabakoff, P.Q.Russell, Gr.Н.Laver

N,0.Кар1ап, Arch. Biochem. Biophys, 178,8, 1977.

2. F С.Womach М. К.Welch

Q.Nielson. S.P.Colowick. Очистка и феррологическое сравнение изоферментов дрожжевой гексокиназы Р-Т и P-TI, Arch. Biochem. Biophys, 158, 1О 451-457, 1973 (прототип).