Способ получения хиноидного пигментарегулятора метаболизма

Способ получения хиноидного пигментарегулятора метаболизма

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП И

ИЗОБРЕТЕНИЯ

<ц771155

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 22. 11. 78 (2l ) 2687982/28-13 (5 t ) M

С 12 D 13/10 с присоединением заявки Нов (23) Приоритет—

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.07 (088.8) Опубликовано 15.1080. Бюллетень Йо 38

Дата опубликования описания 151080 (72) Авторы изобретения

Н.С.Егоров, .Л.И.Буяк, М.П.Колесников, Н.С.Ландау и Т.Г.Мирчинк (71 ). За яв итель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИНОИДНОГО

ПИГМЕНТА-РЕГУЛЯТОРA МЕТАБОЛИЗМА

2 ная кислота в соотношении 6-4:1, хлороформ — этанол в соотношении 95:5, бензин — эфир -в соотношении 5:2.

Полученное соединение обладает токсичным действием на куриные эмбрионы в дозе 50 мг на яйцо.

Недостатками способа являются: длительность способа (1-2 мес); необходимость культивирования продуцента на пищевом сырье (зерно, рис, дрожжевой экстракт), что значительно удорожает производство; получение пигмента из мицелия гриба, что требует высушивания, размалывания и

16-часовой экстракции целевого продукта;-громоздкость и трудоемкость способа.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения иэ плесневого гриба Asper gillus wentii эмодиноокрашенного грибного метаболита антрахиноновой природы 2) .

Способ состоит в том, что гриб

АврегдП 1ив. wentii выращивают поверхностньм методом на раздробленной пшенице с добавлением дрожжевого экстракта в течение 3 нед при 28 С.

Через 3 нед мицелий гриба три раза экстрагируют хлороформом, экстракты

Изобретение относится к способам получения микробных метаболитов и производству протеаз тромболитического действия и может быть применено в микробиологической промышленности, медицине, фармакологии и физиологии.

Известен способ получения из

Aspergiilus wentii окрашенных метаболитов, имеющих максимумы поглощения при 270, 295 и 452 нм (1j .

Способ состоит в выращивании

Aspergillus wentii поверхностным методом в течение 2 мес на зерне или рисе или в течение 1 мес — на среде, содержащей дрожжевой экстракт и са- тз харозу. После этого мицелий отделяют от культуральной жидкости, высушивают, размалывают и экстрагируют хлоро. формом в аппарате Сокслета. Через

16 ч экстракции полученный раствор 20 концентрируют при нагревании в испарителе. Хлороформенные экстракты мицелия очищают тонкослойной хромато. графией на Adsor bosie-1. Полученные пятна экстрагируют смесью хлороформа 5 и ацетона, растворы концентрируют и подвергают рехроматографии в следующих системах растворителей по порядку: хлороформ — ацетон в соотношении.

50г50, толуол — этилацетат - муравьи-.З0

Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного

Знамени государственный университет им. M.Â.Ëoìîíîñoâà

771155 фильтруют в вакууме через безводный сульфат натрия, фильтрат концентрируют и подвергают хроматографии на силикагелевой колонке в градиенте элюции от толуола к этилацетату.

Дальнейшую очистку проводят в системе толуол — этилацетат — муравьиная кислота в соотношении 5:4:1, а затем

-в системе хлороформ — ацетон в соот- ношении 93:7. Эмодин кристаллизуют из этанолового раствора. Полученный препарат обладает величиной DZ 0, равной 3,7 мг/кг, при концентрациях в 12,2 и 37 мг/кг вызывает гибель однодневных петушков в 83% случаев, в меньших же дозах возможно медицинское применение эмодина в качестве слабительного средства.

K недостаткам прототипа относится: длительность культивирования грибапродуцента (21 сут); использование в качестве сред для выращивания продуцента пищевых продуктов, что удорожает способ; пигмент-регулятор выделяют из мицелия гриба, что требует определенных операций по его разрушению; сложность и громоздкость способа, состоящего из многих операций; отсутствие стимулирующего биологического действия на микроорганизмы.

Целью изобретения является придание регулятору стимуляторных свойств в отношении биосинтеза протеаз микроорганизмами, а также ускорение способа.

Поставленная цель достигается тем, что культивирование продуцента ведут на синтетической среде, содержащей сахарозу, глюкозу, КЧОЗ,И9504 и

К НР04 глубинным методом в течение

48-72 ч, а экстракции подвергают культуральную жидкость, предварительно обработанную ацетоном, причем в качестве экстрагента используют азеотропную смесь хлороформ:этанол:вода.в соотношении 91:5:4 или толуол:этанол:, вода в соотношении 51:37:12 и элюирование экстракта при хроматограййи осуществляют смесью бензол:эфир в соотношении 1:1.

Сущность способа состоит в том, что для получения хиноидного пигмента оксиантрахиноновой природы используют культуральную жидкость гриба

A spergi11us wentii, штамм 312, Гриб выращивают на известной и простой по составу синтетической среде, содержащей сахарозу, глюкозу, азотнокислый калий, сернокислый магний и двузамещенный фосфорнокислый калий.

Культивирование продуцента ведут глубинным способом в течение 2-3 сут, что существенно сокращает время,затрачиваемое на получение целевого продукта. Выделение пигмента осуществляют не из мицелия, а из культуральной жидкости, которую обрабатывают ацетоном в соотношении культуральная жидкостыацетон 1:4 — 1:5. Полученную рино- ичеся акность .ед./

Aspergillus КапаЗ0 gawaensis

33,5 520

6,7

Aspergi1l us Kanagawaens1-ь с внесением через 24 ч хиноидного пигмента из культуральной жидкости

Aspergi11us wenQ$ tii

80,5 1054

5,3

Как видно из таблицы, полученный по предлагаемому способу хиноидный пигмент является биорегулятором жизненного цикла и процесса биосинтеза протеаз тромболитического действия

Aspergi11us Kanagawaensis. Введение этого соединения в развивающуюся культуру гриба-продуцента протеаз (Asp.Kanagawaensis) в момент начала синтеза протеаз (24 ч роста) ведет к значительному в 2,0-2,5 раз увеличению выхода протеолитических фербб ментов, обладающих способностью к растворению тромбов крови человека.

Пример 1. В синтетическую среду, содержащую, нес.%: сахарозу

0,72; глюкозу 0,36; КМО 0,2; М9504 ф5 0,123 и К НР04 1,37, после стерилизуя водную фазу высушивают на воздухе до влажного осадка, а затем экстрагируют азеотропной смесью хлороформ: этанол:вода в соотношении 91:5:4 или толуол:этанол:вода в соотношении

51:37:12 обезвоживают и отгоняют в вакууме досуха. Очистку раствора пигмента проводят на активированном силикагеле. Элюирование пигмента осуществляют смесью бензол-эфир.Полученный пигмент имеет максимумы поглощения при 267 и 453 нм и дает характерное окрашивание с уксуснокислым магнием, что позволяет отнести полученное соединение к группе оксиантрахинонов.Пигмент по своей природе бли15 зок к эмодину и ализарину.

B таблице приведены результаты биологического действия полученного пигмента на микроорганизмы.

771155

Формула изобретения

50

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Заказ 6622/36

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ции вносят 5 об.% двухсуточного жидкого посевного материала Aspe rg i 1!us

wentii, выращенного на посевной среде, состоящей из 4-х баллиногового сусла. Культивирование гриба осуществляют глубинным способом в колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалках (200 об/мин) при 28 С в течение

72 ч. По истечении этого времени куль туральную жидкость отделяют от мицелия, концентрируют на роторном испарителе при 40 С, обрабатывают ацетоном н соотношении культуральная жидкость:ацетон 1:5 на магнитной мешалке при 40 С. При этом наблюдается о разделение на два слоя: светло-желтый ацетоновый и темно-оранжевый водный, в котором концентрируется пигмент.

Обработку производят несколько раз до полного обесцвечивания ацетонового слоя. Водный концентрат пигмента

-высушивают на воздухе до влажного остатка, а затем экстрагируют азеотропной смесью хлороформ:этанол:вода в соотношении 91: 5: 4, обезвоживают пропусканием через Na <504, отгоняют в вакууме досуха и растворяют в бенэоле при температуре кипения. Очистку осуществляют с помощью хроматографии на активированном при 200 С силикагеле с элюиронанием смесью; бензолэфир в соотношении 1:1, отгоняют в вакууме досуха, растворяют в хлороформе и получают пигмент, имеющий максимумы поглощения при 267 и 453 нм и обладающий биологическим эффектом стимуляции в 2,5 раза биосинтеза протеаз тромболитического действия плесневым грибом Аspe rgil!us Капада

waensis (см.таблицу).

Пример 2. В синтетическую среду указанного выше состава после.стерилизации вносят 5 об.% двухсутсж- 40 ного жидкого посевного материала

Aspergil1us wentii, .выращенного на посевной среде, состоящей из 4-х бал линогового сусла. Культивирование гриба осуществляют глубинным способом в колбах со 100 мл среды на качалках (2ЛЛ об/мин) при 28 С в течение 48 ч. tlo истечении этого времени культуральную жидкость отделяют от мицелия, концентрируют на роторном испарителе при 40 С и обрабатывают ацетоном по укаэанной вьпые методике при соотношении культуральная жидкость:ацетон равном 1:4. Полученный водный экстракт высушивают на воздухе до влажного остатка, а затем экстрагируют азеотропной смесью толуол: этанол:вода в соотношении 51:37:12, обезвоживают пропусканием через

Na)O<, отгоняют в вакууме досуха и растворяют в бен золе при температуре кипения. Очистку производят по указанной выше методике. Полученный пигмент имеет максимумы поглощения при

267 и 453 нм и обладает биологическим эффектом стимуляции в 2 раза биосинтеза протеаз тромболитического действия плесненым грибом Аьрег9111иь

Kanagawaensis.

Предлагаемый способ по сравнению с известными решениями подобного рода имеет следующие преимущества: получение целевого продукта из культуральной жидкости; получение целевого продукта, обладающего стимулирующим действием на биосинтез протеаз тромболитического действия; ускорение способа; упрощение способа; повышение экономичности способа.

1. Способ получения хиноидного пигмента-регулятора метаболизма из плесневого гриба Aspergillus wentii, предусматривающий его культивирование с последующим выделением целевого продукта путем экстракции органическими растворителями и хроматографии на силикагеле, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью придания регулятору стимуляторных свойств в отношении биосинтеза протеаз микроорганизмами, а также ускорения способа, культивирование продуцента ведут на синтетической среде, содержащей сахарозу, глюкозу,. KN03,MgSO4 и

К НР04 глубинным методом н течение

4Е(-72 ч, а экстракции подвергают культуральную жидкость, преднарительно обработанную ацетоном, причем. в качестве экстрагента используют azeoтропную смесь хлороформ:этанол:вода в соотношении 91:5:4 или толуол:этанол:вода в соотношении 51:37:12 и элюирование экстракта при хроматографии осуществляют смесью бензол:эфир в соотношении 1:1.

2. Способ по н.1, о т л и ч а ю шийся тем, что культуральную жидкость обрабатывают ацетоном,взятым в соотношении 1:4-1:5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Wu M Т.,Ayres J С., Kochler Р.Е.

and Chasis G. Мохiс metabolite produced by Aspergi11us wentii..-"Applied

microbiology", ч.27, 1 2, р.337, 1974.

2. We!ls .M.,Cole R.J.Kirsey J.W.

Emodin,f toxic metahobite of Aspergillus wentii isolated from WeevilDamaged Chestmits.-"Applied microbiology"., 9 1, р.26, 1975 (прототип).