Штамм 203-продуцент нейтральной протеиназы

Штамм 203-продуцент нейтральной протеиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Ресн

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<>771159 (б1) Дополнительное. к авт. саид-ву— (22) Заявлено12.12.78 (21) 2710719/28-13 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет—

Опубликовано 151080. Бюллетень № 38

Дата опубликования описания 1Ы0.80 (я)м. к,.з

С 12 N 15/00

С 12 0 13/10

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15 (088.8) (72) Авторы изобретения

К.В.Саснаускас, Ю.В.Иомантас и И.II Рубикас (71 ) За яв и тель

Институт биохимии AH Литовской ССР (54) ШТАММ BAClLLUS SUBTILIS 203 пРОДУЦент HEATPAJIbH08 пРОтеинАзы

Изобретение относится к микробиологической промыщпенности, в частнос- ти, к получению нового штамма, селективно синтезирующего нейтральную протеиназу. 5

Известен штамм Bacillus subtilis

G-43 — продуцент внеклеточных ферментов, имеющий следующие морфологические и физиологические признаки: клетки палочковидные размерами 1,5-2,7 10 мкм и 0,3-0,5 мкм, обычно не соединенные в цепочки. Палочки подвижные с помощью перитриховых жгутиков, грамположительные, окрашены однообразно, темных форм нет, беэ капсул, как пра-15 .вило эксцентральные, реже — расположенные в центре ° Споры имеют размер

0,9-1,3 мкм 0,5-0,7 мкм, форму цилиндрическую или эллипсоидальную, прорастают экваториально путем разрыва мембраны вдоль экватора.

На мясо-пептонном arape 24-часовая культура образует колонии диаметром 3-4 мм. Колонии беловатые, непрозрачные, тусклые, шероховатые, 25 экстенсивные, складчатые в центральной части, края гладкие.

Aapod. Оптимальная температура роста 36-37оС при рН 6,6-7,0. Гидролизует крахмал, пептонизирует мо- 39

Г

L к к

2f .» «,» локо, разжижает желатину. Ус«вайвае г сахарозу, глюкозу и 1/3 сорбита с образованием кислоты, без выделения газа. Не усваивает лактозу, арабннозу, ксилозу, мальтозу, рамнозу, ман- . нит, дульций, инозит. Нитратов не восстанавливает до нитритоз. Не растет на среде с цитратами (11.

Однако он синтезирует смесь ферментов - нейтральную и щелочную протеиназу, d. -амилаэу, а также образует споры, что приводит к загрязнению внешней среды.

Наиболее близким к изобретению является штамм Васillus subtllis WB

746, продуцирующий нейтральную протеиназу со следующими характерными признаками: клетки подвижные, образующие шероховатые колонии. Величина клеток 2,5-3 мкм < 0,.5-0,7 мкм, трансформабильный аэроб. Свежие колонии белые, после 48 ч инкубации темнеют и становятся коричневыми 32l, Однако этот штамм не обладает достаточной протеолитической активностью.

Целью изобретения является получение нового высокоактивного штамма

Bacillus subtilis, селективно синтезирующего нейтральную протеинаэу, 771159

Таблица 1

Bacillus

subf.1115

we 746

3 5

0,35

Bac1 } 1 Us

subtliis

203

0,12 52,5

0,1 обладающего повышенной протеолитической активностью и большей интенсивностью размножения.

Для получения штамма Bacillus

subti1is 203 исходный штамм Bacillus

subtilis WB 746 обработали нитрогуанидином и бактерии высевали на плотную среду сицайзена, имеющую é4 объема обезжиренного молока. Были отобраны колонии, образующие зоны гидролиза казеина. Исходный штамм на такой среде зон не образует.

Полученный штамм Bacillus subtilis 203 — продуцент нейтральной протеиназы хранится в музее культур . микроорганизмов "ВНИИгенетика". Коллекционный номер ЦМПМ Б-1714.

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, средние размеры О,б-0,8 мкмх2,7-3 мкм, подвижные, грамположительные, находятся отдельно или в виде небольших цепочек 2-4 клетки, окрашены однообразно, темных форм нет, без капсул.

Является аспорогенным.

Культуральные признаки. На мясопептонном arape образует ровные белые колонии, цвет колоний не меняется и при длительной инкубации. Колонии легко суспендируются в жидкости.

Диаметр колонии и односуточной культуры на мясо-пептонном агаре 2-3 мч.

Физиологические признаки. Лэроб, аспорогенный., на споруляционной .среде образует меньше 0,1% терморезистентных спор. Максимальная скорость роста при 37-39 С. Расщепляет казеин, пептонизирует молоко, не расщепляет крахмал. Хорошо усваивает и растет на глюкозе, сахароэе, мальтозе, ацетате, цитрате. Слабо растет на манните, не растет на сорбите и лактозе.

Культура хранится в пробирках на мясо-пептонном агаре под вазелином, а также в лиофилизированном виде.

Для определения активности стерйльнув питательную среду СМ-12 засевают штаммом Baci i 1 us subti l! s 203, после чего инкубируют культуру при

37 С на качалке при 80 об/мин.После

24 ч роста в культурной жидкости определяют активность по расщеплению азоказеина. 3а единицу брали активность фермента, необходимую для расщепления 1 мг азоказеина в течение 60 мин при 30 С.

В табл.1 приведены сравнительные данные активности внеклеточных ферментов предлагаемого штамма Вас111мз

subtilis 203 и исходного Bacillus

subtilis wB 746.

Из табл.1 видно, что предлагаемому штамму характерно практически пблное отсутствие синтеза щелочной протеиназы и aL -амилазы, однако силь-) но повышен синтез нейтральной протеиназы — 150 раз.

Пример. Получение ферментно- го препарата из мутанта Bacillus

subtiiis 203.

Культуру выращивают в течение

24 ч в синтетической минеральной среде. K центрифугату (1,5 л) культуральной жидкости добавляют 3 объема ацетона, охлажденного до(-10 )С.

Образовавшийся осадок центрифугируют и лиофильно высушивают. ПОлученный сухой ферментный препарат растворяют в 0,05 М трис-НС1, рН 7,5, содержащем

0,01 М CaC1< . Исследовали действие ингибиторов: ЭДТА-фенантропина,фенилметан-сульфофторида (ФМСФ). Определяли протеолитическую и амилолитическую активность.

В табл.2 приведены удельные активности центрифугата и ферментного препарата.

Из результатов следует, что в ферментном препарате, а также в центифугате наблюдается высокая активность метаило (нейтральной) протеиназы.Активности сериновой (щелочной) протеиназы практически отсутствуют.

771159 аблица 2

Центрифугат 95

0 0 95 0

Ферментный препарат 120

0 0 120 0

Формула изобретения

Составитель И.Привалова

РедактоР Т.ДевЯтко ТехРеД H.Бабурка Корректор В. Бутяга

Заказ 6622/36 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж- :35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4

Штамм Bacillus subtilis 203 продуцент нейтральной протеиназы хранится в музее культур микроорганизмоВ "ВНИИгенетика". Коллекционный номер ЦМПМ Б-1714.

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, средние раз,меры 0,6-0,8 мкм х 2,7-3 мкм, подвиж .ные, грамположительные, находятся отдельно или в виде небольших цепочек

2-4 клетки, окрашены однообразно, темных форм нет, без капсул. Является аспорогенньм.

Культуральные признаки. На мясопептонном агаре образует ровные белые колонии, цвет колоний не меняется и при длительной инкубации. Колонии легко суспендируются в жидкости. Диаметр колонии односуточной культуры на мясо-пептонном агаре 2-3 мм

Физиологические признаки. Аэроб, аспорогенный, на споруляционной среЩ де образует меньше 0,1% термореэистентных спор. Максимальная скорость роста при 37-39ОС. Расщепляет казеин, пептонизирует молоко, не расщепляет крахмала. Хорошо усваивает и д растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, ацетате,-цитрате, слабо растет на манните, не растет на сорбите, лактоэе °

Культура хранится в пробирках на мясо-пептонном агаре под вазелином, а также в лиофилиэированном виде.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

35 9 538024, кл. С 12 D 13/10, 1975.

2. Doi R Current topics in

ceilular regullation, v.6,ð.1-18, 1972 (прототип).