Способ получения основы для иммобилизации белков

Способ получения основы для иммобилизации белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

"Р»"

\ пкт е«;, б

Союз Советских

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

<11> 776245

Социалистических

Реслублин

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт, свид-ву— (22) Заявлено 23.03.79 (21) 2749179/23-04 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.12.81. Бюллетень № 48 (45) Дата опубликования описания 30.12.81 (51) М.Кл. G 01 И 31/08

C ОЗ В 37/12//

С 07 G 7/00

Государственный комитет по делам изобретений и открытий (53) УДК 543.865 (088.8) (72) Авторы изобретения

О. Б. Кузовлева (71) Заявитель Ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н. Ф. Гамалеи АМН СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВЫ

ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ

Изобретение относится к области молекуляр ной биологии, биохимии,,им мунохимии.

Основными т|ребованиями, которым, должны удовлетворять основы для иммобилизации белков, являются высокая степень сохранения биолопичесиой активности иммобилизова нежных белков и достаточно высокая способность основы иммобилизовать большие количества белка.

Известно, что,в наиболее высокой степени сохраняют свою биологичесиую актив|ность белки, иммобилизова|нные на ocíîaaix, имеющих структуру геля. Сырьем для приготовления таких основ служат ага>р ил.и ага.роза.

Известно несколько способов си нтеза основ для иммобилизации бел ков, приуготовленных из. агира ил и агарозы, в частности шведская фирма «Pharmacia Fine 2о

Chemicals» выпускает основу, получаемую при присоединении ц1ианбромида к определенным образом приготовленному гелю атарозы (CNBr-сефаро з а) !(<1).

Недостатком способа является .относительно ввизкая способность основы иммобилизовать белии (30 мг белка на 1 r ос;новы) .и н еобходимость иствользования высокотоксичпкнго бромциана.

Известен так же способ, основанный на присоеди нении к атару такого вещества-" связ|ки, которое не меняет способности агара образовывать гель и содержит ароматическую аминогр|уппу. С|пособ за ключ а ется во взаимодействии araipa или ага розы и сернокислого эфира 4+оксиэтилсульфон ил2-аминоанизола п ри 75 С. Полученный продукт отмывается на несколыких слоях MBlpли водой. Приготовленяая таким способом основа способна иммобилизовать до 300 мг белка на 1 г своего;веса (21.

Недостаткой данного (clIIQcol6a является недостаточно высокая способность основы иммобилизовать белки. Кроме того продукт содержит:ряд труднараспворимых примесей и не обладает достаточной ста|бильностью, так .как мелкие частицы .ага розы вымываются вместе с труднорастворимыми примесями. Присутствие этих труднораствор имых примесей в основе недопустимо, так как они содержат ахроматическую аминогруп пу и могут конкурировать с основой 3a белок;в процессе:иммобилизации.

Кроме того, высокая температура .иниубации может привести к частичному или полному осмолению основы, что делает ее непригодной для дальнейшего,использования.

776245

3, «с те: - =", -.-> - °

Цель изобретения — увеличение спссобеости основы им мобилизовать белки.

- Это доститается тем, что процесс синтеза п роводят при 20 — 50 С, а отмывку основы осуществляют 2 — 10%-ным раствором НСI.

Такая основа может быть использована .— для тех же целей, что и CNiBr-сефарсза, выпускаемая, за .рубежом, а именно, для

" -выделе«нйя» по аффйннитету,различных веществ,и для специфического их удаления из сложных смесей, а также для .ксличест:вейного определения антител;и антигенсв, что может найти лр и менение в клинике.

Кроме»"того«» "установлено, что основа, при готавлейная«из агара или ага розы описываемым способом, может использоваться в

"тех случаях, когда никакие другие основы использоваться не могут. Сущность этого прнема заключается в том, что иусо«ч«ек геля с иммобилизованньпм на нем белкам

:вносйтся в Сл|ои 1 еля а«ла рa -и« л«и« :ата7розь1«, в котором затем можно проводить любые

;реайКЙЙ, Мфсводйм«йе" з ге»ляГ М Тра ";йли агарозй. Таким образом станови«тся возможным сочетать метод аф«финкой«cop6IIии с любым методом, связанным,c испсльзс юанием геля агара или "ата розы.Способ позволяет получать основу для иммобилизации белков, свссобвую иммсбилизовать .в 2 раза болыш е белка, ievi îc- нова, полученная извеспньгм способом.

Повышейие емкости основы по белку обусловлено:в,ссновном снижением тем пературы реакции, что позволяет избежать о смолейия продукта лри длителынсй .инкуб,ации.

Недопустимые B основе lIIpHMBGH, способные конкурировать с неи за белок, удаляют отмыв кой 2 — 10%-ной раствором НСI, а для получения высокого и стабильного выхода отмывку ведут обычно лри цен«врффгирова нии.

П р и м ер 1. К 20 мл 9%.ного раствора

NaHCO3 при перем«ешивании добавляют

0,6 г лерекристаллизова«н«ного коммерческого сернскислсго эфира 4-р.оксиэтилсульфонил-2-аминоанизсла (ОЭСАА). Раствор отфильтровывают и добавляют 3 г агарозы А завода Оляйне, Через 1 ч жидкость отфильтровывают на бюжерсвской воронке, а оставшийся на фильтре материал lIIepeHoсят н чашку Петри диаметром 5 см, закры вают, помещаютТв те рмостат и инкубируют при 37 С в течение 3,5 суток. После"йнку бации материал отмывают при центрифуги " =рсвани»й диспиллированнои водси при 55—

60 С, затем 2 раза 5%-IHbIIM раствором HCI, после чего,многоиратно водой до IHBHT ральных прсмывных вод.

Получешную основу-для иммобийИЩйи сущат zo» постояйнЖс веса, Коли»честно остатков ОЭС)О, присоедитпи%1пи Y i я tc я Рoй и а АттА а1та пянл lTA .1ГA пичеству входящих в нх GolcTBIB ароматичес ких аминопрупп. Для этого .к 0,5 т получен ной основы добавляют 20 мл 5%.íîão раствора HCI и 400 мг NaiNO>,iIIoñëå инкубации на ледяной бане в течение 30 мин полученное производное отмывают до рН 8,6 и добавляют 20 мл насы|щенлого раствора

Р-,нафтола. Через 1 ч образовавшийся я рКо-розовый продукт отмывают водой;и вы10 сушивают. Высушенный препарат расчзоряют в 90%-нсм расписке Н $04:из расчета 0,5 мг/мл и окраску раствора фстометрируют,при 560 ммк.

Проводят иммобилизацию у-глобулина

15 лошади. Для этого из основы готовят 1%ный гель, его помогениздруют и иниубируют при 4 С в течение 30 MEH в среде 5%ного раствора НС! и 2%-.ного .раствсира

NaNO2, гель отмывают дс .рН 8,,6 и добавляют у-гло булин. Через 48 ч инкубации лри

4 С слределяют количеспво белка, оставше-тося в растворе,-и рассчитывают ксл ичествс белиа, иммсбилизсвавшегсся на единицу Hecà o»ñíoâû. На 1 ir основы удается имMQбилизсвать 636 мг белка.

П р им ер 2. В условиях, описанных в примере 1, приготавливают основу. Синтез отличается лишь тем, что,инкуба цию при

37 С проводят:не 3,5 суток, а 6,5 суток.

Описанным в примере 1 способом определяют количество остатков ОЭСАА, лрисоединившихся z агарозе. В этих условиях синтеза получают основу с емкостью,в:3,9

IpB за выше, чем емкость основы, получен ной известным слоссбсм. Недопустимые

- лримеси в основе отсутствуют. Выход 47%.

П,р и м е р 3. Б условиях, QIIIHcaнHblх в примере 1, готовят основу для иммобилизаци и белксB. Синтез отличаепся лишь тем, 4О что и нкубацию проводят лри 20 С в течение 18 суток. Полученная основа содержит

:в 1,7 раза больше остатков ОЭСАА, чем .при синтезе,в условиях, ioiIIHcalHiHbIx в iIIpQтотиле. Недопус«видимых примесей не содер4 жит, осмслевия н е наблюдается. Выход

52%.

При.ме.р 4. Препарат по примеру 1, нс инкубацию проводят в течение 2 суток при 46 С. Полученная основа содержит в

2,6,раза больше остатков ОЭСАА, чем при синтезе в условиях, олисанных;в прототипе. Недопустимых примесей нет, ссмсления не наблюдается. Выход 46%.

TamM образом, описываемый способ позволяет, используя отечественное;или импор пное сырье, приготовить основу, содержащую в 3 — 4 рауа большие количества остатков . ОЭСАА,и способную,в связи с этикам иммобилизсвать, по KjpBHHåé мере, в

2 раза большие количества белка, чем основа, lIIplHIIoòoâëåííàÿ из импс ртнотс сырья известным способом.

Описываемый способ отмывки такой основы 2 1О /0-Hoie раствора НСI дает воз65 мвжнпатк спалить тпчлноояатвооимкта ппи776245

Формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Техред 3. Тараненко Корректор С. Файн

Редактор Л, Горькова

Заказ 32/39а Изд. № 654 Тираж 915 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5К-35, Раушскаи наб., д. 4/5

Тип. Харьк. Фил. пред. «Патент» меси, способные конкурировать с основой за белок в момент иммобилизации. Отмывка при цантрифупцровании позволяет получить высокий и стабилыный;выход готового продукта.

Способ приготовления основы годен для передачи,в производство.

Слосо б получения основы для,иммобилнзаци и белков аутем взаимсщействия araра или .ага|розы с сернокислым эфиром 4Р-оксиэтилсульфонил-2-.аииноанизола нри повышенной темпер.атуре с последующей отмывкой основы водой, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью увеличения апособности основы,HMMp6HJIH39BaTb белок, луоцесс проводят. при 20 — 50 С, после чего осуществляют птредварительную отмывку полученной основы 2 — 10%-HbIM,раствором

НС1.

Источники иноформации, вринятые во внимание при экспертизе:

10 1. «Affinity Chromatography», Booklet, - - -.Pharmacia Fine Chemistry, Sweden, 1977.

2. Кузовлева О. Б. Выделение индивидуаль ных белков лри IIIGIMoEIJH новых иммуносорбентав, способных присоединять большие количества антигена ДАН, СССР, 2ОЗ, 5, 1972, с. 1193 — 1197 (проторена).