Способ получения антибиотического комплекса тенебримицина
Патент 776566
Авторы
Классы МПК
Способ получения антибиотического комплекса тенебримицина
Иллюстрации
Реферат
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Союз Советскик
Социапистическик
Республик
К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (51)М. Нл (22) Заявлено 2704.79 (21) 1157604/28-13
2758949/28-13 (23) Приоритет 10,05,67 (32) С 12 0 9/00
Государственный комитет
СССР оо делам изобретений и открытий (33) (31)—
Опубликовано 30,10,80. Бюллетень Йо 40 (53) УДК 615.779..931 (088.8) Дата опубликования описания 30,1080
Иностранцы
Роберт Куинси Томпсон, Уильям Макс Старк и Калвин Евгений Хиггенс (72) Авторы изобретения
b 7 (США) -,«) « -ц .!. Иностранная фирма
"Эли Лилли энд Компани" (71) Заявитель (СШ) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО
КОМПЛЕКСА TEHESPHMHgHHA
Изобретение относится к области микробиологии, а именно к получению антибиотиков.
Предложенный антибиотический комп- 5 лекс новый и способ его получения в патентной и научно-технической лите, ратуре не описан.
Целью изобретения является получение антибиотического комплекса тене- ð бримицина, содержащего фракции тенебримицина 3, 1 и 11.
Эта цель достигается тем, что штамм Streptomyces tenebrarius АТСС
17921 выращивают в питательной среде,1> содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях при температуре 37-43 С . в течение 4.-7 дней, выделяют антибиотический комплекс в свободном виде или в виде его солей и/или разделяют на составляющие его фракции.
Штамм Streptomyces tenebrar|us выделен из образца почвы посредством суспендироваиия отдельных порций об- 25 раэца почвы в стерильной дистиллированной воде с последующим переносом суспензий на питательную среду .
Штаьве Streptomyces tenebrarius хранится в коллекции культур амернканского типа в Вашингтоне (Федеративный округ Колумбия QIIA) под номером ATCC 17921.
Культурально-морфологические признаки . Воздушный мицелий и споры отсутствуют, фрагмент мицелия в состоянии вегетации в незначительных количествах.
Агар Чапека. Вегетативный рост удовлетворительный, цвет желтовато» белый, воздушный мицелий и растворимтй пигмент отсутствуют.
Агар, содержащий кальциевую соль яблочной кислоты. Вегетативный рост умеренный, цвет серовато-желтый, воздушный мицелий отсутствует, незначительное количество сероватокоричневого растворимого пигмента.
Пирозиновый агар. Вегетативтый
Рост умеренный, цвет серовато-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.
Агар с неорганическими солями и крахмалом. Вегетативный мицелий удовлетворительный, цвет светлый, желтовато-коричневый растворимый пигмент.
Агар с глюкозой и аспарагином.
Вегетативный рост умеренный, цвет
776566 серовато-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.
Томатная йаста с овсяной мукой.
Вегетативный мицелий умеренный, цвет желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.
Дрожжевой экстракт. Вегетативный мицелий умеренный, цвет светлый, желтовато-коричневый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.
Питательный агар. Вегетативный рост умеренный, цвет светло-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.!
Агар Беннета. Вегетативный рост умеренный, цвет серовато-желтый, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствуют.
Физиологические. признаки. Действие на молоко: толстое окрашенное кольцо роста на поверхности, наблю- 20 дается коагуляция и пептонизация.
Нитраты восстанавливает..
Сероводород не образует.
Полностью сжижает желатин через
7 дней. 25
Растет при температуре 26, 30, 43, 49 и 55 С, оптимальная температура роста 37 С.
Хорошо усваивает фруктозу, маннозу, глюкозу, мальтозу, трегалоэу, i-инозитол .
Не усваивает серабинозу, рамнозу, рибозу, лактозу, сукрозу, раффинозу, целлюлозу, маннитол, d-сорбитол, салицин.
Штамм Streptomyces tenebrarius
ATCC 17921 культивируют в условиях погруженной аэробной культуры в среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неоргани.ческих солей. 40
Штамм растет при температуре от
30 до 50 С, оптимальные температуры
37-43 С.
Штамм чувствителен к действию света и плохо растет при освещении, поэтому ферментацию осуществляют в отсутствии видимого света.
Через среду для выращивания культуры продувают стерильный воздух.
Объем воздуха, используемый в процес 0 се ферментации в крупных резервуарах, составляет свыше 0,1 объема воздуха в минуту на один объем среды.
Концентрация, характеризующая активность антибиотика в ферментационной среде, может быть прослежена посредством отбора и испытачия проб среды для выращивания на их активность в отношении ингибирования роста организмов, которые должны тормозиться в своем развитии в присут- 60 ствии тенебримицина. Для этой цели применяют организмы Klebslella pneumoniac u Micobacterium butyricum.
Мицелий и нерастворившиеся остатки удаляю= из ферментационного бульо- 65 на фильтрацией или центрифугированием. Антибиотик содержится в профильтрованном бульоне и может быть извлечен из него путем адсорбции. К числу адсорбентов, которые могут быть использованы, относятся катионообменные смолы, например, !RC-50 °
Тенебрийицин из ферментационного бульона извлекают следующим образом.
Бульон отфильтровывают с применением средств, способствующих фильтрованию, после того, как показатель рН снижен до 2 добавлением кислоты, например, .серной, фосфорной, хлористоводородной и других подобных им. После этого рН фильтрата доводят до 5 добавлением концентрированной щелочи, и смесь снова фильтруют. Полученный фильтрат пропускают через ионообменную колонку, заполненную ионообменной смолой !RC-50 в аммонийном цикле.
Затем колонку промывают дистиллированной водой, и антибиотик извлекают с адсорбента вымыванием разбавленной кислотой. Фракции, содержащие активное действующее начало, объединяют и концентрируют приблизительно до, 1/20 от первоначального объема. рН концентрата повышают примерно до 11 добавлением концентрированной щелочи ( после чего щелочной концентрат выливают в шестикратный объем ацетона, хорошо перемешивают и охлаждают. Выделяющийся осадок, не обладающий активностью в микробиологическом отношенйи, устраняют фильтрованием, рН фильтрата понижают до 3,5 добавлением 20%-ной серной кислоты при тщательном перемешивании. Тенебримицин в виде комплекса осаждается в форме сернокислой соли. Сернокислую соль тенебримицина растворяют в минимальном количестве воды и водный раствор пропускают через колонку с Доуэксом.
Водный раствор сульфата тенебримицина доводят в колонке дистиллированной водой, после чего жидкость, вытекающую из колонки, собирают в виде отдельных фракций. Активные фракции объединяют и концентрируют до консистенции густого сиропа, затем высушивают с целью получения тенебримицина в виде свободного основания, Основной фактор, образующий комплекс тенебримицина можно получить, если это желательно, в виде раздельных антибиотиков посредством дополнительного фракционирования на колонках, заполненных ионообменной смолой тенебримицина, полученного как описано выше. Для проведения фракционирования тенебримицин применяют в виде соли, являющейся продуктом присоединения кислоты. Пригодной солью является в данном случае сульфат.
Раствор сульфата тенебримицина удобно получать посредством приготовления
20%-ного водного раствора тенебримицина с последующей установкой показа776566
1,000
0,100
0,300
0,050
0,500
0,025
1i00 геля рН раствора приблизительно 4,5 путем добавления серной кислоты. Окрашенные примеси можно удалить с помощью перемешивания приготовленного как указано раствора примерно с 5% (весое количество по отношению к объемному) актнвированного угля, такого, например,как "Дарко G-60".Эффективное обесцвечивание достигают в результате перемешивания смеси, содержащей активированный уголь, в течение одного часа. После этого смесь фильтруют, и фильтрат, который содержит сульфат тенебримицина, помещают в колонку, заполненную ионообменной смолой марки IRC-50 s аммонийном цикле. Колонку промывают водой, после чего индивидуальные антибиотики, образующие комплекс тенебримицина, фракционированно отмывают в адсорбенте с помощью 0,1 н.раствора гидрата окиси аммония. Процесс элюирования идет медленно, и для получения эффекта фракционирования комплекса обычно бывает необходимо очень большое число фракций. Так, например, полное и законченное фракционированне примерно .250 r тенебримицина требует получения около 700 фракций, каждая из которых содержится примерно в 900 мл жидкости, отмываемой с адсорбента.
Первая полученная активная фракция содержит тенебримицин.
Пример 1. Ферментация S. tenebrar i us штамма ATCC 19721, Спорулированную культуру 5.tenebrarius ATCC 17921 получают посредством вырашивания организма на модифицированной среде Беннета в виде скошенного агара, имеющего следующий состав, r:
Декстрнн 10,00
Дрожжевой экстракт ("Дифко")
Гидролизованный казеин (продукт под наименованием "NZамин A") 2,00
Экстракт из мяса крупного рогатого скота 1,00
CaClg 6Н О 0,01 — Промытый агар 20,00
Деионизированная вода До 1000 мл
Значение показателя концентрации водородных ионов рН доводят до 7 до автоклавирования.
Скошенную среду засевают спорами
S. tenebrar l us ATCC 17921 и культивируют в отсутствии видимого света в течение пяти дней при температуре 37 С. Культуру, выращенную на скошенной среде, покрывают водой, и наклонную поверхность осторожно соскабливают, удаляя споры с целью получения водной суспензии, содержащей споры.
Полученную укаэанным образом сус- пензию спор применяют для инокулиро-: вания среды, имеющей состав, вес.Ъ:
Декстроза 0 050
Питательная соевая мука, содержащая
35-45% диспергирующегося протеина 1,500
Декстрин с низким содержанием хлоридов
Хлористы калий
NZ-амин А
КН Р04
HgS0л 7НтО
СаС i ° 2Н О
Деионизированная вода Остальное.
Инокулированную вегетативную среду инкубируют при температуре около
37 С в течение 16 ч на аппарате для перемешивания путем встряхивания при .
2Q одновременном вращении со скоростью
250 об/мин °
Для инокулирования резервуара для посева емкостью 44 л берут водную среду следующего состава, вес.Ъ:
Декстроэа 1,000
Соевая крупа 1,500
КН1 04 0,050
И9504 0,500
Хлористый калий 0,100
Са С > ° 2Н <О О, О 25
З" Средство против вспенивания 0,025
Применяют порцию вегетативной куль- туры объемом 50 мл.
Среду, находящуюся в резервуаре для посева, стерилизуют при 120 С в течение 30 мин. Инокулированную среду в резервуаре для посева инкубируют при 379С в течение 12 ч. Перемешивание со скоростью 370 об/мин
40 начинают немедленно после инокулирования. В продолжение всего периода инкубирования осуществляют аэрацию при скорости подачи воздуха 0,22 м /мин.
К концу периода инкубации содер4 жимое резервуара для посева используют для инокулирования ферментатора емкостью 1,14 м или 0 95 мь, содержащего среду следующего соста- . ва, вес. Ъ:
Декстроз а 4,0
Соевое масло рафинированное 3,0
Соевая мука 3,0
Хлористый аммоний 0,5
Хлористый кальций 0,3
Сернокислый аммоний 0,2
Азотнокислый агоний 0,1
NZ-амин-A 0 5.
Средство против образования пены 0,2
Деиониэированная вода Остальное.
До инокУлирования ферментационную среду стерилизу10т 30 мин при
120 С, ферментацию проводят при .
37 С. Аэрацию осуществляют при ско-.
6д рости подачи воздуха 0,48 м /мин
776566
1 в течение всего периода выращивания, начиная от инокулирования ы кончая сбором выращенной культуры. Перемешивание начинают при скорости вращения мешалки 120 об/мин. Через
12 ч число оборотов мешалки увеличивают до 180. Процесс ферментации продолжают 5 дней. Полученный таким путем профильтрованный бульон после ферментации содержит комплекс, имеющий главным образом тенебримицин 11 и в меньшей пропорции — тенебримицин
1и 1
Пример 2. Изолирование комплекса тенебримицина.
Значение показателя концентрации водородных ионов у 880 л ферментационного бульона; содержащего антибиотик и полученного, как указано в примере 1, понижают приблизитИтЪно да рН-2 путем добавления 10-15 л
20%-ного водного раствора серной кислоты. К подкисленному бульону добавляют 45 кг средства, способствующего фильтрованию, тщательно перемешивают смесь и фильтруют. Отжатый осадок, оставшийся на фильтре, промывают водой и промлвные воды добавляют к фильтрату. рН Фильтрата доводят до 5,5 посредством добавления 50%-ного водного раствора гидрата окиси натрия.Добавляют примерно 4 кг средства, способствующего фильтрованию, смесь тщательно перемешивают и фильтруют. Полученный фильтрат пропускают через колонку, имеющую размеры 10,2 см х х 1,8 и (4 дюйма х б футов), заполненную ионообменной смолой марки IRC-50. Колонка имеет слой смолы вйсотой 111,7-114,3 см и действует по аммонийному циклу. После того, как весь фильтрат. пропустят через колонку ; последнюю промйвают"дистйллированной водой в количестве около
200 л. Активное действующее начало, характеризуемое свойствами антибиотика, затем отмывают с адсорбента в течение 12-15 ч примерно 150-175 л
0,1 н.раствора серной кислоты. Элюат собирают в виде фракций по 10 л каждая. Присущая антибиотику активность в составе элюата становится распознаваемой в случае снижения величины рН до 4 или несколько менее. По мере . продолжения отмывки рН элюата продолжает снижаться до тех пор, пока его значение не достигнет 1,5. Фракции содержащие активное начало антибиотика, объединяют и концентрируют при уменьшенном давлении приблизительно до 1/20 от первоначального объема. дят до 11 добавлением 50%-нОго водно"го раствора -гйдра "а окиси натрия, пос ле чего подщелоченный концентрат добавляют к б-ти объемам ацетона. Полу чейную смЕсь охлаждают и отставляют в сторону для того, чтобы дать отделиться осадку, лишенному активности, свойственной антибиотиКу. Затем смесь фильтруют и плотную массу, отжатую на фильтре, и состоящую из неактивного осадка, отбрасывают. рН устанавливают 3,5, добавляя при тщательном перемешивании 20%-ный водный раствор серной кислоты. Во время такой обработки комплекс тенебримицина осаждается в виде сульфата. Практи о чески полное осаждение достигается при рН раствора около 4 или несколько менее. Смесь фильтруют и фильтрат содержащий церуломицин, попутно образующийся в процессе Ферментации, отбрасывают.
15 Отжатый.на фильтре осадок, являю-щийся сульфатом тенебримицина, растворяют в минимальном количестве воды и охлаждают. Все твердые вещества, растворяющиеся более или менее трудно, Щ отбрасывают, наряду со всеми твердыми веществами, выпадающими в виде осадка йли кристаллизующимися при охлаждении, прозрачный раствор сульфата тенебримицина пропускают через насадку
2» из ионообменной смолы марки "Дауэкс
1х1" размером 10,2 см х 2,1 м, работающую по основному циклу. Раствор антибиотика выводят иэ колонны с применением 40-50 л дистиллированной воды. Жидкость, выходящую иэ колонны, собирают отдельными фракциями,до 10л.
Активные фракции объединяют, концентрируют в вакууме до консистенции густогоФ сиропа, который после высушивания на противне дает сухой тенебримицин.
Пример 3. Сульфат тенебримицина,, содержащий факторы 1, 1 и 11 получают путем добавления концентрированной серной кислоты к 20%ному водному раствору, содержащему
4р 258 r комплекса тенебримицина в виде свободного основания, с таким расчетом, чтобы рН среды стало равным
4,5. Полученный таким путем раствор сульфата тенебримицина перемешивают
4» примерно один час с 5% (весовое количество по отношению к объемному) активированного угля марки "Дарко 0-60,", Затем раствор фильтруют и фильтрат пропускают через колонку размером
9х105 см, заполненную примерно 7 л ионообменной смолы марки IRC-50 и работающую в аммонийном цикле.
После того, как Фильтрат, содержащий соль антибиотика был пропущен через колонку, ее промывают прибли»» зительно 17 л деионизированной воды.
Вымывание активной части антибиотика, задержанной в колонке, начинают с помощью 0,1 н,раствора гидрата окиси рн бйцентрйрованно о злюата"дово- аммония, подаваемого со скоростью щ около 20 мл в 1 мин. Элюат собирают отдельными фракциями приблизительно по 900 мл, причем каждую Фракцию проверяют на микробиологическую активность. Фракции, содержащие фактор антибиотика 11 объединяют и высуши776566
6,25 (1,56 (1,56
3,12
50 00
Стафилококкус ауреус 3055
Бациллус субтилис
Микобактериум авиум
Стрептококкус фекалис
Лактобациллус казей
I вают из замороженного состояния с целью получения индивидуального высушенного тенебримицина,11.
Пример 4. Получение гелиантата тенебримицина 11.
2 r тенебримицина 11 растворяют в 22 мл воды и .рН раствора доводят до 5 50%-ной серной кислотой. Затем к раствору антибиотика добавляют горячий 10%-ный водный раствор меTHJI-îðàíæà. Гелиантат тенебримицина
11 выделяют в виде осадка, который .отделяют фильтрованием. Твердую соль тщательно промывают горячей водой и высушивают в вакууме. В итоге получают 3,5 r гелиантата тенебримицина 11. l5
Тенебримицин 11 является белым твердым веществом. Электрометрическое титрование в водной среде показывает наличие способных титроваться группировок, имеющих значения рН 2п около 5,7, 6,7; 7,7 и 8,7. Удельное вращение, определяемое в свете линии
0 натрия при температуре 25 С, обусловленное данным фактором, равно
+159о, если концентрация антибиотика
1%, считая на весовое количество, приходящееся на единицу объема в водном растворе.
Тенебримицин 11 имеет следующий состав, Ъ: С 46,47; Н 7,99; и 13,05;
Молекулярный вес по результатам титрования около 539.
Эмпирическая формула С21 Н4 ЙЬО .
Инфракрасный спектр поглощения тенебримицина 11 в среде, содержащей минеральное масло, имеет следующие различные полосы в составе спектров инфракрасного поглощения в пределах от 2 до 15 мкм: 3,02; 3,14;
6 05, 6 23; 7 4; 8 5; 8 75; 9 17.; 40
Тенебримицин 11 образует ацетильное производство, имеющее с около
+130о при концентрации соединения
1%, считая на весовое количество, 45 приходящееся на единицу объема в водном растворе. У производного. не имеется оставшихся группировок, способных титроваться. Элементарный состав, определенный по методу микроорганизма, показывает, что к структуре тенебримицина 11 были присоединены четыре ацетильные группировки.
Соли, являющиеся продуктами присоединения кислот к тенебримицину или отдельным компонентам, входящим в состав антибиотика, можно получить с помощью обычных методов. Для образования соли можно применять или органические или неорганические кислоты. Удобный метод получения таких 6О солей заключается в добавлении раст» вора кислоты, служащей для образования, к водному раствору антибиотика..
В случае нерастворимых солей, являющихся продуктами присоединения кислоты, соль осаждается иэ раствора и легко отделяется с помощью обычных технических приемов, таких как фильтрование или центрйфугирование.В случае, когда желаемая соль, являющаяся продуктом присоединения кислоты, не осаждается с достаточной легкостью, процесс осаждения можно усилить, концентрируя раствор до меньшего объема или добавляя к воде смааивающийся с ней растворитель, такой как ацетон или подобный ему. Соль, являющаяся продуктом присоединения кислоты, можно без труда снова перевести в форму свободного основания путем пропускания водного раствора соли над анионообменной смолой в гидроксильном цикле.
Различные "факторы", образующие тенебримициновый комплекс, можно отличить один от другого, а также от других антибиотиков, обладающих сходными свойствами, с помощью технических приемов бумажной хромато- графии. Хроматографию проводят но обыЧному нисходящему методу при температуре 22,8+0,6 C. Константа миграции для каждого из антибиотиков выражена как константа R, а отличие от более распространенного значения
Rg. Значение константы Ra выражает соотношение между расстоянием, проходимым антибиотиком, по отношению к концу ленты скорее, чем фронт растворителя.
Тенебримицин обладает ингибирующим действием по отношению к росту микроорганизмов, патогенных для жизнедеятельности животных и растений ° Ингибирующие концентрации, при которых проявляется тормозящее действие, приведены в таблице . Минимальные ингибирующие концентрации были определены по методу разбавления агара со свободным основанием.
Острая токсичность тенебримицина
11 отмечается при внутривенном введе-, нии мьмам s дозе около 385 мг/кг.
Новый комплексный антибиотик, соответствующий настоящему изобретению получается в результате культивирования.
11, 776566
Продолжение таблицы
ПРодолжение таблицы
Эрвиния амилофора
Псевдомонас соланацерум
5 Ксантомонас фазеоли
Лейконосток- центрофорум
Эшерихия колн 9 1
Эшерихия коли 9 2
1,56
25,00
12,50
Протеус сп. 9 1
Протеус сп. 9 2
Псевдомонас сп. 9 2 Псевдомойас сп. 9 5
Клебсиелла аэробактер
9 14
12,50
Клебсиелла аэробактер 9 15
Сальмонелла сп. 9 1
Вибрио мечниковии
12,50
25,00
12,50
Arpîáàêòåðèóì тумефациено
25,00
Составитель С. Малютина
Редактор Н.Спиридонова Техред И.Асталош Корректор М.Вигула
Заказ 7798/70 Тираж 522 . Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент",г. ужгород, ул. Проектная, 4
50, 0
25, 0.0
50,00
100,00
25,00
25,00
12,50—
Предлагаещюй способ позволяет получить новый антйбиотический комплекс генебримицина. формула изобретения
10. Способ получения антибиотического комплекса тенебримицина, содержащего Фракции тенебримицина 1, 1" н 11, о т л и ч а ю щ и и с .я тем, что, штамм Streptomyces tenebrartus
i5 ATCC 17921 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях при температуре
37-43оС в теченйе 4-7 дней, выделяют
20 антибиотический. комплекс в свободном виде или в виде его солей, и/или разделяют на составляющие его фракции.