Биоспецифический сорбент для аффинной хроматографии трипсина

Биоспецифический сорбент для аффинной хроматографии трипсина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

i 1177704l

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 18.04.78 (21) 2607809/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 07.11.80. Бюллетень № 41 (45) Дата опубликования описания 07.11.80 (51) М. К .

С 076 7/02

В 01Р 15/08

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.07 (088.8) (72) Авторы изобретения Д. Я. Дайя, P В. Берзиня-Берзите, В. Х. Кирее и А. К. Арен (71) Заявитель (,"1 т (54) БИОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ СОРБЕНТ ДЛЯ АФФИННО 1

ХРОМАТОГРАФИИ ТРИПСИНА

1 2

Изобретение относится к биоспецифическим сорбентам для аффинной хроматографии, в частности для очистки трипсина.

Аффинную хроматографию применяют для получения высокоочищенных препаратов, которые находят широкое применение в химической и микробиологической промышленности, а также в научно-исследовательской работе в качестве биохимических реактивов. 10

Известно применение в аффинной хроматографии биоспецифических сорбентов общей формулы P — М вЂ” 1., где P — матрица органической или неорганической природы;

М вЂ” промежуточное соединение (активатор), ковалентно связывающее матрицу с лигандом L; 1. — лиганд, соединение, обладающее сродством к сорбируемому ферменту (ингибитор или аналог субстрата).

Известен, например, биоспецифический сорбент для аффинной хроматографии трипсина на основе агарозы, активированной диазотированием, в котором в качестве лиганда используют ингибитор трипсина из соевых бобов (1), 25

Обычно биоспецифичность сорбента в основном зависит от выбранного ингибитора, который должен быть строго специфичен к определенному ферменту.

Используемый в данном сорбенте ингибитор трипсина из соевых бобов обладает биоспецифичностью не только к трипсину, но и к химотрипсину, поэтому на нем невозможна полная очистка трипсина от примесей химотрипсина.

Наиболее эффективными являются сорбенты, содержащие в качестве лиганда овомукоид, строго специфический к трипсину ингибитор природного происхождения, применение которого позволяет получить целевой продукт без примесей химотрипсина.

Известен, в частности, биоспецифический сорбент, в котором в качестве матрицы используют сефарозу 4В, в качестве активатора М, обеспечивающего взаимодействие матрицы с лигандом, — цианобромид, а как лиганд — ингибитор овомукоид, применяемый для аффинной хроматографии трипсина (2).

Полученный сорбент содержит примерно

26 мг овомукоида на 1 мл препарата и обеспечивает очистку трипсина до чистоты

48 — 52 ед. БАЭЭ (этиловый эфир бензоиларгинина) /мкмоль/мин/мг белка.

Известный сорбент обладает высокой биоспецифичностью к трипсину и позволяет получать целевой продукт без примесей химотрипсина.

Однако сорбент на основе сефарозы механически непрочен и нестабилен, подвергается биологической атаке. Недостатками сорбента являются также его высокая стои777041

ОН

I

Р О Я1 (СН2) 111

О йомукоид р -g — „ -(c,н,1 -мн + г !

Сипохоом, оорйоотанный

f- амимоорооипгприэлюпоисипапом он

I — p -о — $I -(á )-,—

1 он он

0H.

О8омукоио

I э )-о-$ — (", — N !

ОН мость (цена сефарозы 125 руб/кг); загрязнение им окружающей среды, так как в качестве активатора используют сильно ядовитое и отравляющее вещество — цианобромид; недостаточно высокая степень 5 оч истки тр и п сии а.

Предлагается новый биоспецифический сорбент общей формулы

Силохром обогащают аминогруппами об- 15 работкой p-аминопропилтриэтоксисиланом, затем активируют и-бенохиноном. К полученному активированному носителю присоединяют овомукоид, растворенный в боратном буфере при рН 8,0 в течение 1 ч при 20 комнатной температуре.

Овомукоид присоединяется в положении

5 хинонового цикла с помощью в-аминогруппы лизина или концевых аминогрупп белков, что обеспечивает прочную и стабильную связь, не нарушает ингибиторную способность овомукоида. Полученный сорбент содержит 45 — 50 мг овомукоида на 1 г сухого сорбента.

Силохром благодаря своему неорганическому происхождению обладает жесткой, неизменяемой микроструктурой, которой обусловливаются механическая прочность, долговечность, хорошие гидродинамические свойства и возможность повторной регенерации сорбентов на основе силохрома. Сорбенты на основе силохрома также устойчивы против воздействия микроорганизмов. где P — остаток силохрома, для аффинной хроматографии трипсина.

В предлагаемом сорбенте матрицей служит силохром, в качестве промежуточных соединений (активаторов) используют аминопропилтриэтоксисилан и п-бензохинон, а в качестве лиганда — овомукоид.

Такой сорбент получают следующим образом.

Силохром обрабатывают у-аминопропилтриэтоксисиланом по известной методике:

Благодаря стабильной связи и-бензохинона с овомукоидом и также микроструктуре нерастворимой матрицы силохрома достигается высокое содержание овомукоида в сорбенте: 45 — 50 мг на 1 г сухого носителя, что, в свою очередь, повышает эффективность очистки трипсина. Достигается чистота прапаратов трипсина 64 — 67 ед.

БАЭЭ/мкмол/мин/мг белка.

Овомукоид-силохром три раза дешевле овомукоид-сефарозы (цена силохрома

40 руб./кг) .

Использование в качестве активатора а-бензохинона позволяет исключить применение цианобромида — сильного яда и отравляющего вещества. Преимуществом предлагаемого сорбента является также возможность его регенерации прокаливанием при 500 — 900 С с повторной активацией согласно изобретению, Срок использования такого сорбента

2,5 — 3,0 месяца.

Пример 1. Используют силохром (СХ-2), выпускаемый Горьковским опыт777041

5 ным заводом ВНИИ нефтяных продуктов ВТУ-341671 (Д 920 А, S 71 м /г, К„р 1,63 смз/г; фракции 0,1 — 1,0 мм).

В колбу наливают 350 мл 1,5 /О-ного рас- 5 твора Т-аминопропилтриэтоксисилана, при перемешивании вносят 100 г силохрома (СХ-2) и выдерживают в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем жидкость декантируют и осадок высушивают в тер- 10 мостате при 130 С в течение 4 — 5 ч.

К 0,5 г силохрома, обработанного у-аминопропилтриэтоксисиланом (содержащим

200 мк-экв. аминогрупп на 1 г носителя), прибавляют 30 мл 70 /О-ного раствора изо- 15 пропилового спирта, который включает

0,105 г п-бензохинона, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем носитель отфильтровывают, промывают

3)(20 мл изопропилового спирта и высуши- 2о вают. Получают 0,5 r носителя, содержащего 200 мк-экв. хиноновых групп на 1 г носителя. Далее активированный носитель пропитывают 1,7 мл раствора овомукоида в боратном буфере с рН8 (содержащем 25

25 мг овомукоида) и выдерживают в течение 1 ч в вакууме (15 — 20 мм рт. ст.) при комнатной температуре.

После этого препарат фильтруют, промывают боратным буфером, рН 8,0, 1 М ЗО раствором хлористого натрия и еще раз дополнительно боратным буфером для удаления несвязанного белка.

Полученный сорбент содержит 45 мг овомукоида на 1 г сухого носителя. 35

Пример 2. К 1,0 r силохрома, обработанного у-аминопропилтриэтоксисиланом (содержащим 250 мк-экв. аминогрупп на 1 г носителя), прибавляют 60 мл 70 /О-ного раствора изопропилового спирта, содержащего 4р

0,21 r n-бензохинона, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем носитель отфильтровывают, промывают

3)(40 мл изопропилового спирта и высушивают. Получают 1,0 r носителя, содержаще- 45

ro 250 мк-экв. хиноновых групп на 1 r носителя. Далее активированный носитель пропитывают 3,5 мл раствора овомукоида в боратном буфере с рН 8,0 (содержащем

50 мг овомукоида) и выдерживают в течение 1 ч в вакууме (15 — 20 мм рт. ст.) при комнатной температуре.

После этого препарат фильтруют, промывают боратным буфером, рН 8,0, 1 М раствором хлористого натрия и еще раз дополнительно боратным буфером для удаления несвязанного белка.

Получают сорбент, содержащий 50 мг овомукоида на 1 г сухого носителя.

П р и м ер 3. К 5,0 г силохрома, обрабо- @ танного у-аминопропилтриэтоксиланом (содержащим 240 мк-экв. аминогрупп .на-1 г носителя), прибавляют 300 мл 70 /о-ного раствора изопропилового спирта, содержащего 1,05 г п-бензохинона, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем носитель отфильтровывают, промывают 3;х,200 мл изопропилового спирта и высушивают. Получают 5,0 г носителя, включающего 240 мг-экв. хиноновых групп на 1 r носителя.

Далее активированный носитель промывают 17,5 мл раствора овомукоида в боратном буфере, рН 8,0 (содержащем 250 мг овомукоида) и выдерживают в течение 1 ч в вакууме при комнатной температуре. После этого препарат фильтруют, промывают боратным буфером, рН 8,0, 1 М раствором хлористого натрия и еще раз дополнительно боратным буфером для удаления несвязанного белка.

Получают 15,0 rвлажного носителя,,содержащего 48 мг овомукоида на 1 г сухого носителя.

Приготовленный биоспецифический сорбент для аффинной хроматографии трипсина вносят в колонку (1,9)(25 см) и промывают до уравновешивания 0,05 М буферным раствором ТРИС-НС1, содержащим

0,02 М хлористого кальция, рН 8,0, при комнатной температуре. 210 мг производственного трипсина (производства ОЗХР марки Б) с удельной активностью 16 ед.

БАЭЭ/мкмоль/мин/мг белка растворяют в

40 мл 0,05 М ТРИС-HCl-буфера, рН 8,0, содержащего 0,02 М хлористого кальция, и фильтруют через бумажный фильтр.

Фильтрат наносят на колонку с уравновешенным тем же буферным раствором биоспецифическим сорбентом. Скорость пропускания жидкости через колонку

40 мл/ч. После нанесения раствора трипсина колонку промывают тем же буферным раствором до отрицательной реакции на белок у выхода колонки. Десорбцию проводят при температуре от 0 до 4 С пропусканием через колонку 0,05 М буферного раствора глицина — НС1, рН 2,2 — 2,3, до отрицательной реакции на белок у выхода колонки. Фракции трипсина собирают и после диализа лиофильно высушивают. Получают

140 г очищенного трипсина с удельной активностью 64 ед. БАЭЭ/мкмоль/мин/мг белка. Степень очистки 4 раза.

Выход препарата — высокоочищенного трипсина с активностью 64 — 67 ед.

БАЭЭ/мкмоль/мин/мг белка зависит от времени использования колонки с биоспецифическим сорбентом.

За единицу эстеразной активности трипсина принято количество фермента, которое за 1 мин при 30 С и рН 8,0 катализирует расщепление 1 мкмоль БАЭЭ.

Технико-экономический эффект изобретения заключается в создании стабильного, долговечного и дешевого биоспецифического сорбента для аффинной хроматографии.

Использование такого сорбента обеспечивает получение высокоочищенных препара777041

ОН

I и (СН2)5 14M

Обомдгсид

Составитель О. Скородумова

Техред И. Пенчко

Редактор 3. Бородкина

Корректор P. Беркович

Заказ 2706/19 Изд. № 594 Тираж 497 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 тов трипсина, которые по качеству не уступают продукции ведущих фирм мира.

Формула изобретения

Биоспецифический сорбент общей формулы

ОН где P — остаток силохрома, для аффинной хроматографии трипсина.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Мосолов В. В., Лушникова Е. В. Принцип очистки пептидгидролаз, основанный

5 на применении нерастворимых ингибиторов белковой природы, «Биохимия», т. 35, 1970, вып. 3.

2. N. S. Robinson, R. W. Туе, Н. Neurath, К. А. Walsh Isolation of trypsin by affinite

10 chromatography, «Biochem.», 1971. V. 10, № 14, р. 2743 — 2747.