Способ получения ингибитора террилитина

Способ получения ингибитора террилитина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е 00777058

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ссвз Советских

Социалистических

Реслублик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 15.06.78 (21) 2628822/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (51) M Кл з

С 129 13/00

Государственный комитет (43) Опубликовано 07.11.80. Бюллетень № 41 (53) УДК 615.779.94 (088.8) ло делам изобретений и открытий (45) Дата опубликования описания 07.11.80 (72) Авторы изобретения

А. П. Кашкин, Л. Б. Стати, Г. В. Дмитриева, Н. А. Силина, А. Г. Алексеева и И. М. Терешин

Всесоюзный научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения (71) Заявитель

rt (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ТЕРРИЛИТИа1А I

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения микробного ингибитора протеолитического фермента террилитина.

Известен способ получения ингибитора протеиназ путем выделения целевого продукта из фильтра культуральной жидкости продуцента,(1), Однако препарат, полученный известным способом, не ингибирует террилитин. 10

Целью изобретения является получение ингибитора террилитина, обладающего высокой ингибирующей активностью.

Эта цель достигается тем, что культуральную жидкость Actinomyces enzystaticus 15

sp. nov ЛИА-0114 экстрагируют н-бутанолом в соотношении 1: 0,5 — 2, полученный бутанольный экстракт депигментируют, затем концентрируют в вакууме при 60 — 70 С, осаждают целевой продукт из концентрата 20

4 — 5 объемами этилацетата при подщелачивании, далее полученный осадок трехкратно экстрагируют водой и доводят рН водного экстракта до 6,8 — 7,2.

Кроме того, депигментацию проводят с помощью активированного угля, а подщелачивание ведут 10 -ным раствором гидроокиси натрия.

С целью повышения стабильности ингибитора к водному экстракту перед лиофили- 30 зацией добавляют 0,5 — 1,5% полиглюкина.

Способ осуществляют следующим образом. Ингибитор экстрагируют н-бутанолом из фильтрата культуральной жидкости в течение 30 мин при комнатной температуре и периодическом перемешивании. На 1 об. фильтрата берут 0,5 об. растворителя. После расслоения органическую фазу (верхний слой) отделяют и отфильтровывают в вакууме, освобождаясь при этом от осадка высокомолекулярных веществ (белки, полисахариды и др.).

Для удаления содержащегося в экстракте коричневого пигмента к прозрачному фильтрату добавляют активированный уголь марки «А» (рН водной суспензии

5,0 — 6,0) из расчета 2 г на 100 мл бутанольного экстракта. После перемешивания в течение 30 мин уголь отделяют фильтрованием на бумажном фильтре для тонких осадков. Бесцветный прозрачный фильтрат концентрируют 30 раз в вакууме на ротационной испарительной установке при температуре не выше 60 — 70 С.

Для осаждения ингибитора к 1 об. упаренного экстракта добавляют 4 об, этилацетата медленно при постоянном перемешивании. С целью более полного осаждения раствор после добавления этилацетата подщелачивают 10% -ным раствором NaOH

3 (1 мл щелочи на 100 мл полученной смеси), Образовавшийся осадок белого или бледно-желтого цвета отделяют центрифугированием на холоде при 2000 об/мин в течение 15 мин. Полученный осадок собирают и взвешивают. Препарат ингибитора трижды экстрагируют из осадка дистиллированной водой (по 50 мл воды на 1 г влажного осадка). Нерастворимую часть отделяют центрифугированием при 2 тыс. об/мин в течение 15 мин. Надосадочные жидкости объединяют и нейтрализуют до рН 6,5—

7,0 0,1 н. раствором НС1. Полученный раствор ингибитора лиофилизируют. С целью снижсния потерь активности при лиофилизации, а также для стабилизации препарата к нейтрализованному раствору ингибитора добавляют полиглюкин в количестве

0,5 — 1,5%. Препарат ингибитора не содержит примесей балластных белков и имеет активность до 0,46 ИЕ/мг. Выход продукта из 1 л фильтрата культуральной жидкости составляет 0,3 — 0,4 г.

Полученный препарат содержит 5 пептидов, среди которых преобладают 2 пептида, подавляющие активность террилитина.

Для-получения гомогенного препарата ингибитора проводят дополнительную очистку методом гель-фильтрации. Очистке на «Сефадексе q-10» подвергают водный нейтрализованный экстракт ингибитора без добавления полиглюкина, Активные фракции, собранные на автоматическом коллекторе, объединяют и лиофилизируют. Целевой продукт является индивидуальным веществом. Активность его 0,9 ИЕ/мг.

Полученный препарат ингибитора хорошо растворим в воде, изотоническом (0,85% -ном) растворе NaC1, фосфатном буфере (рН 7,5), водном метаноле, слабо растворим в диметилсульфоксиде, этаноле, не растворим в этилацетате, диэтиловом эфире, хлороформе и ацетоне.

Препарат дает характерную реакцию на пептиды с реактивом Рейндел-Хоппе, но не реагирует с нингидрином, бензидином, реактивом Эрлиха, реактивом Джаффе, реактивом Саккагучи. Аминокислотный анализ солянокислотных гидролизатов показал, что ингибитора содержит в преобладющих количествах валин и следовые количества аланина, треонина, серина, аргинина и лизина.

Водные растворы ингибитора сильно поглощают при длине волны 210 — 220 нм и слабо — при 250 — 290 нм.

Пример 1. Выделение ингибитора из фильтрата культуральной жидкости Act.

enzystaticus sp. nov. ЛИА-0114.

Культуральную жидкость фильтруют через двойной складчатый бумажный фильтр.

Ингибиторную активность фильтрата и последующих растворов ингибитора определяют спектрофотометрическим методом по подавлению каталитической активности тер7?7058 рилитина при гидролизе высокомолекулярного субстрата казеина в сравнении с пробами, не содержащими ингибитора, Для этого к раствору ингибитора (0,5 мл) до5 бавляют 0,5 мл раствора террилитина с активностью 1,0 — 1,2 Пе/мл и 2 мл 1%-ного раствора казеина, приготовленного на 1/15 М фосфатном буфере (рН 7,6). Раствор казеина подогревают до 37 С. Параллельно ста10 вят контрольные пробы, к которым вместо раствора иигибитора приливают 0,5 мл дистиллированной воды. Опытные и контрольные пробы инкубируют 10 мин при 37 С, после чего ферментативпую реакцию останавливают, добавляя 2,5 мл 5%-Hои трихлоруксусной кислоты. Осадок неразрушенного субстрата отделяют центрифугированием. Оптическую плотность прозрачных надосадочных жидкостей определяют на спектрофотометре СФ-4А при длине волны

280 нм.

Ингибиторная активность препарата характеризуется количеством единиц протеолитической активности (ПС) фермента, нейтрализуемых 1 мл или 1 мг ингибитора.

За единицу ингибиторной активности (ИЕ) принимается такое количество ингибитора, которое нейтрализует 10 единиц протеолитической активности (ед. ПС) ферЗ0 мента.

В данном примере в. результате фильтрования культуральной жидкости получено

12,4 л фильтрата (нативного раствора).

Протеолитическая активность террилитина в контроле — 0,5 ПЕ, в присутствии разведенного в 500 раз ингибитора — 0,317 ПЕ, тогда удельная ингибиторная активность

1 мл фильтрата будет: (О, 5 — О, 317) Х2 Х 500 .1,83ИЕ/мл

100

65 или 1,83)(12400 = 22800 ИЕ/весь объем, где Q2 — пересчет на 1 мл раствора ингибитора;

;х,500 — учет разведения фильтрата;

1 пересчет на количество ингиби100 торных единиц.

К 12,4 л нативного раствора приливают

6,2 л н-бутанола. Проводят экстракцию при комнатной температуре при периодическом перемешивании в течение 30 мин. Получают 6 л бутанольного экстракта ингибитора с активностью 3,1 ИЕ/мл. Бутанольный экстракт депигментируют на активированном угле марки «А» при перемешивании в течение 30 мин. К 6 л экстракта добавляют

120 г угля. Депигментированный бутанольный экстракт отделяют от угля фильтрованием в вакууме. Объем полученного фильтрата 5,7 л, активность 2,35 ИЕ/мл. Экстракт концентрируют при Пониженном давлении при 60 — 70 С до 0,190 л. Активность концентрата 70,0 ИЕ/мл. Энзистатин осаждают из концентрата этилацетатом, добав