Способ получения вакцины против инфекций, вызываемых

Способ получения вакцины против инфекций, вызываемых

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советскии, Социалистическнд

Республик

< 1784796 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 040277 (21) 2448254/28-13. (23) Приоритет - (32) 05. 02. 76 (31) 10838/76 (33) Япония

Опубликовано 30.11,80,Бюллетень ¹ 44 (51)М. Кл 3

С 12 К 5/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДН 615. 372 (088.8) Дата опубликования описания 30,1180 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Юзуру Хомма и Казуюки Морихара (Япония) Иностранная фирма

"Сионоги энд Ко, ЛТД, Дзе Китасато Институт" (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ. ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМЫХ PSEUOOHONAS AERUGiNOSA

Изобретение относится к вакционно-сывороточному производству.

Известен способ получения вакцины против инфекций, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, на основе натурального эндотоксинного белка, полученного из Pseudomonas aeruginosa ).1) .

Однако вакцина, полученная известным способом, обладает недостаточно высокой иммуногенностью.

Целью изобретения является повышение иммуногенных свойств вакцины.

Эта цель достигается тем, что натуральный эндотоксинный белок, токсоид эластаэы иэ Pseudomonas

aeruginosa и токсоид протеазы из

Pseudomonas aeruginosa растворяют в растворителе до концентрации 0,120000 g /мл, 1-4000 /мл и 14000 ) /мл соответственно и смешивают. их в,этих концентрациях в стерильных условиях.

Кроме того, в качестве растворителя используют дистиллированную воду, физиологический раствор или фосфатно-буферный раствор хлористого натрия.

С целью удлинения сроков хранения! вакцину вводят антисептик тиморосал, фенол, карболовую кислоту или формали н ., Способ осуществляют следующим образом.

5 Токс ид эластазы приготавливают из эластазы путем перевода ее в токсоид по обычной методике получения токсоидов из белковых токсинов обработкой формальдегидом или оксиме1Р тансульфиновой кислотой.

Чистый раствор эластазы (содержащий 10-15 мг ферментного белка на

1 мл (50 единиц протеиназы на 1 мг ферментного протеина), 5 молей хло15 ристого натрия, 10 ммолей ацетата натрия, 2 ммоля хлористого кальция и 0,1 ммоль хлористого цинка), разбавляют буфером бората (pH 9) до концентрации фермента 2-5 мг/мл

2р (окончательная концентрация бората составляет 0,1 И) и добавляют формалин до получения окончательной концентрации 1% (процентное соотношение объемов). Смесь выдерживают

25 при комнатной температуре. Через один день достигается почти полная дизактивация. Дезактивированный .таким образом раствор эластаэы диализируют водой и лиофнлиэируют

3Р до получения токсоида.

784796

Под термином "единица протеиназы", используемым здесь, подразумевается активность протеиназы, определяемая по следующей методике.

Казеин (2% по процентному соотношению объемов, РН 7,4) (1 мл) смешивают с соответствующим образом разбавленным раствором фермента и по окончании реакции при 40ОС в течение 10 мин немедленно добавляют останавливающий реакцию растВор, содержащий 0,1 моль трихлоруксусной кислоты, 0,2 моля уксусной кислоты и 0,2 моля ацетата натрия .(2 мл ). Смесь выдерживают при той же температуре 20 мин до полного осаждения непрореагировавшего каэеина и затем профильтровывают. ФильЪрат подвергают определению на тирозин по методике Фолайна. Увеличение 1 ед. тирозина в минуту указывает на активность протеиназы равную единице.

Физические и химические свойства полученного таким образом токсоида эластазы следующие.

Молекулярный вес: 47000 (фильтрация геля) .

Спектр поглощения ультрафиолетового иэлучения: максимально 278 нм (Е „ 8 = 21,2,0,1 М KC Р), минимально

1"!о

2 5 2 нм .

И зозл ек триче с к ая точка: рН 6, 5 (эле к трофоре э с ацетат ной пленкой) .

Внешний в ид : бесцветный порошок .

Содержит остатки аминокислот, г / 1 О 0 r белка: аспара ги новая 1 4, 2, т ре они н 5, 0 ; проли н 2, 9, глици н 5, 6 ; ал ани н 5, 8, валин 4, 9 ; ме тио ни н 2., 9 ; и золей ци н 2, 7 ; лейци н 3, 9 ; тироз и н

9, 9., фе нилалани н 7, О ; лизин 3, 9 ; гистиди н 2, 6 ; арги ни н 6, 5 ; ци с тин - 2 1, 2 0 трипто фа н 2, 3 ; аммиак 0, 9, всего 9 4, 7 г .

Ак ти в ность эластаэы не наблюдается .

Акт ивность ан тигена наблюдается .

Токсоид протеазы может быть приготовл е н и з протеазы переводом ее в то ксоид обработкой, например, формал ьде гидом или оксиметанс ульфинатом в присутствии аминокислоты .

Пример получения токсоида протеазы .

Кристаллы прот еазы и з P s e u d o mo n a s а е r u g l и о ь а (10 0 мг ) растворяют в

0, 1 М растворе и а Н Р 0, содержащем

0,2 моля лизина (около 20 мл) и добавляют формалин до получения окончательной концентрации 8% (процентное соотношение объемов ). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 3-х или более дней и затем подвергают диализу водой и лиофилизации.до получения токсоида.

Физические и химические свойства полученного таким образом токсоида протеаэы следующие.

Ниже приводятся некоторые примеры предпочтительных доз и пропорций антигенов.

Для человека (a также для рогатого скота) ..

Когда иммунизацию проводят 2-3 раза в неделю (без присадки ), предпочтительны следующие пропорции: НЭБ

Молекулярный вес: 63000 (фильтрация геля).

Спектр поглощения ультрафиолетово. го излучения: максимально 280 нм (Е ф= 9,27, 0,1 М КС1), минимально

250 нм.

Изозлектрическая точка: РН 5,2 (фокальный электрофорез).

Внешний вид: бесцветный порошок.

Содержит остатки аминокислот, г/100 г белка: аспарагиновая 15,6;

10 треонин 5,0, серии 7,6, глутаминовая

9,5, пролин 2,1; глицин 7,7; аланин

8,5; валин 5,0; изолейцин 3,9, лейцин 8,7; тирозин 6,9, фенилаланин

5,9, лизин 4,1; гистидин 1,9, арги15 нин 2,3, триптофан 2,3, аммиак 1,4; всего 98,5 г.

Активность протеазы не наблюдается.

Активность антигена наблюдается.

Для получения вакцины инфекционно-защитный обычный антиген натурального эндотоксинного белка (.НЭБ),токсоид эластазы и токсоид протеазы растворяют в растворителе в оптимальной пРопорции. При необходимости в полученный раствор может быть добавлена усиливающая действие присадка и/или антисептик.

Растворитель может быть использован любой, приемлемый для приготовЗО ления вакцин для человека и животных, например, дистиллированная вода, физиологический раствор хлористого натрия, раствор хлористого натрия, содержащий фосфат в качестве

З5 буфера и т.д.

В качестве присадки может быть использована любая обычная присадка, например, гидроокись алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция, 4О квасцы или неполная присадка Фреунда.

Количество присадки можно выбирать из предела количеств, необходимых и достаточных для повышения активности иммунизации.

Р

Антисептик также может быть обычным, например, тимеросал, фенол или формалин.

Для повышения защитного эффекта пропорцию компонентов в вакцине можно изменять в пределах эффективных количеств. Количество каждого компонента значительно изменяется в зависимости от количества иммунизаций и от интервала между иммунизациями.

Оно изменяется также в зависимости от цели использования вакцины (т.е. профилактического или терапевтического).

78479б

,0,1-10 ед. на 1 кг веса тела, токсо1 ид протеазы 1-50 ед. на 1 кг веса тела, токсоид эластазы 1-50 ед. на

1 .кг веса тела. В зависимости от состояния иммунизации эти количества могут быть увеличены.

Профилактическая вакцина.

Когда иммунизацию проводят два раза (c использованием присадки) предпочтительны следующие пропорции:

НЭБ 10-2000 ед. на голову, токсоид протеазы 10-2000 ед. на голову, токсоид эластазы 100-2000 ед. на голову.

Когда иммунизацию проводят один раз, рекомендуются следующие пропорции: НЭБ 500-2000 ед. на голову, токсоид протеазы 500-4000 ед. на голову, токсоид эластазы 500- 4000 ед. на голову.

Терапевтическая вакцина.

Когда иммунизацию проводят 2 3 раза с интервалом н одну неделю (с использованием или без использования усиливающей действие присадки), предпочтительны следующие пропорции:

НЭБ 0,1-100 ед. на голову; токсоид протеазы 10-2000 ед. на голову, токсоид эластазы 10-2000 ед. на голову.

Вакцину можно вводить животным или человеку внутримышечйо или подкожно.

Токсичность каждого компонента в вакцине следующая.

НЭБ: инъекция в брюшину мыши дозы 100 мг/кг вызывает временную астению, однако животное не погибает.

При обычном испытании на кроликах в отношении свойств НЭБ вызывать пирекцию наблюдается положительный эффект с дозой 0,3 мг/кг. Токсичность

НЭБ как эндотоксична очень мала в сравнении с токсичностью липополиозы (ЛП ) и смеси НЭБ и ЛП.

Токсоид эластазы и токсоид протеазы. Введение ннутрибрюшинно мыши дозы 1 мг на вес мыши не вызывает острого отравления. Минимальная летальная доза протеазы составляет

0,2 мг на вес мыши, а минимальная

1летальная доза эластазы — 0,125 мг на вес мыши.

При иммунизации вакциной эффект защиты от инфекций, вызываемых

P.аеruginosa, значительно увеличивается в сравнении с иммунизацией простой вакциной, содержащей только

НЭБ. Поэтому вакцина высоко эффек-. тивна-для профилактики и лечения инфекций, вызываемых P.àerugiиоsa у животных и человека.

Антитела или сыворотку, содержащую антитела, которую получают прививкой накцины животным и человеку, можно использовать для защиты ран (например язн, роговиц) от инфекций, вызываемых Pseudomonas ае.ruginosa, и для их лечения.

Пример 1. Раствор токсоида протеазы и калиеных квасцов.

5S

Токсоид протеазы (100 мг) растворяют в водном растворе хлористого натрия, содержащем 24,8 мл фосфатного. буфера (рН 7,4), и добавляют 25 мл

10Ъ-ного раствора калиевых квасцов

К2А1 (SO< )< ° 24Н О. К полученному раствору добавляют 2,5 мл 20В-ного раствора йа НРО 12Н О и устанавлиР вают рН 6,5, чтобы вызвать полное осаждение. После этого добавляют

1Ú-ный раствор тимеросала (0,3 мл) н качестве антисептика (1 мг токсоида протеазы на 0,3 мл).

Раствор токсоида эластазы и калиевых квасцов. Раствор приготовляют так же, как и н первом случае, но с использованием токсоида эластазы вместо токсоида протеазы.

Раствор НЭБ и калиевых квасцов.

НЭБ (100 мг) растворяют в 0,01 н. растворе NaOH (5 мл ) и добавляют фос атный буфер (28 мл) . К полученному раствору последовательно добавляют

10%-ный раствор калиевых квасцов (3,3 мл) и 203-ный раствор Na2HPOq (3,3 мл), после чего добавляют 1Вный раствор тимеросала (0,4 мл).

Приготовленные таким образом растнор токсоида протеазы и алюминиевых квасцов, раствор токсоида эластазы и алюминиевых кнасцов и раствор НЭБ и алюминиевых кнасцов непосредственно перед использованием перемешивают.

B 0,5 мл этого смешанного раствора содержится 500 ед. токсоида эластазы, 500 ед. токсоида протеазы и

500 ед. НЭБ. ,Пример 2. Раствор токсоида протеазы и гидроокиси алюминия, раствор токсоида эластазы и гидроокиси алюминия и раствор НЭБ и гидроокиси алюминия приготовляют так же, как в примере 1, но с использованием

10%-ного раствора гидроокиси алюминия вместо 103-ного раствора калиевых квасцов.

Приготовленные таким образом,три раствора перемешивают непосредственно перед использованием.

Полученная вакцина обеспечивает гораздо больший эффект защит от инфекций, вызываемых P.aeruginosa в сравнении с обычной вакциной, содержащей только НЭБ.

При использовании одного НЭБ (группа A) 205 составляет 3,5 х 10 или меньше. В отличие от этого н группе Б, иммунизированной вакциной, ZDMпревышает 1,9 х 109 и, тем самым, она сущестненно отличается от группы А. В необработанной группе ZDBo составляет 3,4 х 105. При иммунизации

НЭБ величина 20бообычно от 100 до

l000 рае повышает сопротивление к

<оличеству живых бактерий в сравнении с необработанной группой.

При использовании йредлагаемой вакцины, содержащей токсоид протеазы

784796 живых бактерий в 104 †1 раз большее в сравнении с необработанной группой (см.таблицу). и токсид эластазы в дополнение к

НЭБ, иммунизированные животные приобретают сопротивление к количеству азы) + (2) + (7) + (1) + (1) (1) + (2) + (2) + (2) + (1) + (4) + (1) + (1) + (1)+(1) + (1) + (2) +(1)+(1)+(1}+(2)+(2) + (1) + (1)

С З,бх 10 .)1,9х 10

3,4 х 10

П р и м е ч а н и я. Плюс означает гибель одного животного, цифры в скобках — количество дней до .:бели, минус — выживание. Я - .исло выражает величину, полученную рас="етом по результатам нескольких экспериментов, проведенных ранее (а не у результат этого эксперимента).

A — Б К (0,1.

Вакцина, полученная предлагаемым 4000 $ /мл соответственно и смешиваспособом, обладает повышенными имму- ют их в этих концентрациях в стерильногенными свойствами. ных условиях.

2. Способ по п,,1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве раствоФормула изобретения рителя используют дистиллированную воду, физиологический раствор или

1. Способ получения вакцины про- фосфатно-буферный раствор хлористого тив инфекций, вызываемых Pseudornonas натрия.

aeruginosa на основе натурального 3. Способ по п.1, о т л и ч а ю эндотоксинного белка, полученного шийся тем, что, с целью удлинения из Pseudomonas aeruginosa, о т л и сроков хранения, в вакцину вводят ч а ющи и с я тем, что, с целью антисептик тимеросал, фенол,. карбоповышения йммуногенных свойств вак- ловую кислоту или формалин. цины, натуральный эндотоксинный бе- Источники информации„ лок, токсоид эластазы из PseudoI1lonas принятые во внимание при экспертизе

aeruginosa и токсоид протеазы из 1. Хомма Ц.l0. Иммунитет, создаваеPseudornonas aeruginosa растворяют мый препаратами микроорганизмов. Тов растворителе до концентрации 0,1- кио, изд. Токийского университета, 2000 /мл, 1-4000 /мл и 1- 55 1975, с. 267-279.

Составитель С.Малютина

Редактор Н. Спиридонова Техред М. Кузьма Корректор Г ° Назарова

Заказ 8598/68 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5-35, Раушская наб., д. 4/5

2 х10 б х 105

2 «10

6х10

2 х10 бх10

2 х 108 бх 10 б х 10

+ (1) + (1) + (1)+(3 ) + (.1) — (1) - (3) - "

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4