Способ определения гаптена в антигене

Патент 784872

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

О"П" И С А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

<и1784872

Союз Советски1

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. сеид-ву

1 (22) Заявлено 300179 (2! ) 2718621/28-13 (я)М. КЛ.3

A 61 В 10/00//

6 01 и 33/54 с присоединением заявки №

Государственный комитет

СССР по деяам ныбретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 071280.6юллетеиь ¹ 45 Дата опубликования описания 071280 (5.1) УДК 576. 8. .097.2(088.8) (72) Авторы изобретеиия

И.Я. Мошиашвили и Н.Е ° Канделаки (71) Заявитель Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПТЕНА В АНТИГЕНЕ

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть ис" пользовано для определения вакцинных препаратов из антигенных комплексов энтеробактерий. 5

Известен способ определения гапте. на s антигене методом электрофореза в агаре (1).

Однако известный способ не позволяет определить точное количество 10 гаптена в антигене.

Целью изобретения является количественное определение гаптена на уровне отдельных рецепторов.

Эта цель достигается тем, что 15 эритроциты параллельно сенсибилизируют исследуемым антигеном и референс-гаптеном, затем определяют их специфическую лактивность в реакции массивной гемаглютинацйи и по разнос 20 ти гоказателей специфической активности определяют количественное со-. держание гаптена в антигене.

Кроме того, сенсибилизирующая до,за исследуемого антигена в 10-20 раз 25 превышает сенсибилизирующую дозу референс-гаптена.

Пример. Свежие или формалинизированные эритроциты отмывают физиологическим раствором рН 7,2 30 (раствор ь. 2) центрифугированием при

5-10 С со скоростью 2800-3000 об/мин.

Осадок ресуспендируют до 2,5% концентрации фосфатным буфером рН-6,4 с содержанием 0,85% хлорида натрия (раствор Р 1) и разливают в стерильные флаконы по 10-.25 мл. На каждый исследуемый препарат и контрольный гаптен берут по 3 флакона и в четвертый флакон заливают контрольные эритроциты. В первые 1-3 флакона добавляют разведенный раствором Р 1 исследуемый антиген.

Сенсибилизирующие дозы антигена равняются 50-100 мкг антигена на

1 мл 2,5% эритроцитав. Параллельно

Ы другие 1-3 флакона добавляют референс-контрольный гаптен. Ультразвуковой 0-антиген обрабатывают 0,02 М

NaOB при теМпературе 100 С 2 ч. Полученный гаптен диализуют и лиофилизируют.

Иммунизация кроликов ультразвуковым 0-антигеном вызывала нарастание титров антител до 1:25000-1:50000.

После обработки 0-антигена NaOH титры сывороток были равны или меньше

1:160-1:320. Сенсибилизирующая доза гептена в 10-20 раз меньше исследуемого антигена и равняется 5 мкг гап784872 тена на 1 мм 2 5 мм,5% зритроцитов. Кроме более концентриров того, готовят контрольные зритроци- является плотный о ты, т.е. в один флакон добавляют Число рядов зав физиологический аство раствор в том же ва исследуемых ант объеме, что и разведенный антнген и торных сывороток. гаптен. Количество гапт

Для сенсибилизации зритроцитов мом препарате оп е все флаконы ставя ф ставят в термостат или равнивания специфи е опре - в водяную баню при 37 С на 2 ч. За диагностикумов, пр это время содержимое всех флаконов исследуемого антиг перемешивают 3-4 раза. По ис еченйи препарата с иэвест времени сенсибилизации процесс пре-. 10 гаптена. если спец кращают добавлением 0,4% формальде- - -ность диагностик м д р 6,4 (конечная концентрация). из исследуемого ан ум

Формальдегид добавляют в виде 4Ъ гаптена при сенсчб раствора, разведенного раствором Р 1. с десятикратным ра

Содержимое флаконов осторожно переме- 15 вы, то содержание шивают до и после добавления форма- емом антигене бУде лина и оставляют при комнатной тем- с 20-кратным разли пературе 60 мин.Содержимое флаконов Например, если разливают в центрифужные пробирки, тивность контрольн уравновешивают и центрифугируют в те 2О сенсибНлизирующей чение 10 мин при 2,8-3 тыс. об/мин ется 1:40, а специ п и +5 +10 р 10ОC. Полученный ос док дваж- ность опытного пре ды отмывают раствором Р 2, а затем лиэирующей дозе 50 ресуспендируют до 2,5% концентрации ется 1:40, то аз э

1/15 М

/ М фосфатным буферным раствором исследуемый антиге р, с 0,85. хлорида натрия и

25 тена. При эт6м исп

0 4о фо ма ф рмальдегида. Полученные диаг. цепторная сыворотк ностикумы и контрольные эритроциты ровать с контрольн исследуют в РАНГА с использованием . рованными эритроци агглютинирующих адсорбированных мо- исследования антиг норецепторных О-сывороток. из различных энте

РПГP, ставят на полистероловых способами, прЕдста ер пластинках или используют бактерио- и 2). логические пробирки с круглым дном.

В ряды лунок или пробирок разливают

Иэ табл. 1 ви н по 0,4 мг раствора Р 2 (по 12 лунок 35 или пробирок) . по лунок тодом триптическог

В первую лунку или пробирку до бавляют разведенную в 2,5 раза сыво ротку, тщательно перемешивают и переносят во вторую лунку или пробирку 0,4 мл и т.д., титруют 10 лунок илИ пробирок. Из последних лунок или пробирок 0,4 мл выливают. Титруют

3 раза. В первый ряд вносят диагностикум, приготовленный нэ гаптейа, во второй - диагностикум, приготовленный из исследуемого антигена, в тре-. . тий добавляют контрольные несенси-билизированные эритроциты. Диагностикумы добавляют в количестве 0,050,07 мл в каждую лунку или пробирку.

Пластины или пробирки встряхива-. ют и оставляют при комнатной температуре на 3 ч или до следующего дня на 1ф-20 ч, после чегo производят учет реакции.

Реакцию учитывают по следующей схеме: (+) вЂ” положительная (эритроциты равномерно устилают всю поверхность дна лунки или пробирки); (-) вЂ” отрицательная (на дне пробирки нли лунки плотная "пуговка" или "колечко" правильной формы); (+) вЂ” переходная (эритроциты распределяются по дну лунки, пробирки анно, по краю пободОк) . исит от количестигенов и монорецепенов в исследуеделяют путем прической активности иготовленных иэ ена и контрольного ным количеством ифическая активов, приготовленных тигена и референсилизирующих дозах зличием, одинакогаптена в исследут равняться 10%, чием вЂ” 5Ъ и т.д. специфическая акого препарата при дозе 5 мкг равняфическая активпарата,при сенсибимкг также равнятого следует, что н содержит 10% гац ользуемая монореа не должна реагиымн несенсибилизитами (результаты енов, полученных обактерий разнымн влены в табл. 1 о, что брюшнотифоэ59, полученная мео переваривания при сЕнсибилизирующей дозе 50 мкг, дает чувствительность к рецептору .

0-9 в разведении 1:40 и к рецептору

0-12-1:20. При этом референс-гаптен

40 при сенсибилиэирующей дозе 5 мкг к рецептору 0-9 обладает чувствительностью в разведении 1:40, а к рецептору 0-12 также в разведении 1:40.

Из этого следует,что в данной серии

4 айтйгена (вакцины) содержатся 103 гаптена к рецептору 0-9 и 5% к рецептору 0-12. Это означает, что общее содержание гдптена в исследуемом антигене по двум исследуемым рецепторам (0-9 и 0-12) равняется 15Ъ.При .-исследовании аналогичного антигена было установлено, что антиген серии

38 содержит 5% гаптена к рецептору

0-9 и 2,5% гаптена .к рецептору 0-12.

Так как эти исследования проводились параллельно в аналогичных условиях (с использованием одной серии контрольного гаптена, формалинизированных эритроцитов, монорецепторных сывороток и т.д.), можно сравнивать

60 количество содержания 0-антигенов и

0-гаптенов в препаратах производства различных предприятий. Хотя исследуемые брюшнотифозные антигены были приготовле*ны по одной техноло65 гии (методбИ триптического перевари784872

Содержание гаптенов к рецепторам, Ъ

Обратные титры сывороток в РПГА

;и рецепторам

100 100

2,5

100

1,25

100

50, Нет

Нет

100

Нет

100

Нет

Нет вания) разными предприятиями с помощью предлагаемого метода, в короткий срок возможно установление качественных и количественных различий между ними на уровне отдельных рецепторов О-антигена. Так, было установлено, что содержание гаптенов в О-антигене производства Ташкентского

НИИВС в два раза меньше, чем в аналогичном антигене производства Ленинградского НИИВС (7,5 и 15% соответствеино). Таким образом, возможно и установление количественного содержания О-антигенов в исследуемом препарате (вакцине) простым вычислением: в препарате производства Ленинградского НИИВС содержится 15% гаптенов (по рецепторам 0-9 и 0-12), а на долю антигена приходится 85%, в препарате Ташкентского НИИВС

7,5 и 92,5Ъ соответственно. Аналогичные качественные и количественные различия были получены при исследовании других серий О-антигенов, которые представлены в табл. 1.

В брюшнотифоэных антигенах, выделенных методом прогревания бактери- . альных суспенэий при 56-57@С в течение 1 ч (гретая вакцина), обнаружено содержание гаптена к, рецептору

0-9 1ОЪ, к 0-12 5Ъ. При исследовании .

Исследование гаптенов в б

Серия брюшнотифоэных СенсибилиО-антигенов- зирующая доза препарата на

1 мл 2,5% эритроцитов

Контроль О-гап. тен серия II

О-антиген ЛенНЙИВС серия 59

О-антиген ТашНИИВС серия 38

0-антиген ТашНИИВС серия 38 (а) О-антиген ЛенНИИВС се- рия 36

О-антиген ЛенНИИВС серия 36 (а) О-антиген ЛенНИИВС серия 52 (а)

0-антиген(гретая вакцина)МНИИВС серия 1

0-антиген (фаголиэат)

ТбилНИИВС серия 3

Ультразвуковой О-антиген неактивизированный серия 2

О-антигенов, полученных с помощью дезинтеграции бактерий фагон (фаголизат) и ультразвукового брюшнотифозного О-антигена, гаптены в них не oeiнаруживаются.

Исследование антигенов, полученных из других сальмонеллезных бактерий (сальмонелла мышиного тифа) с по,мощью гидроксиламина при 57 С в течение 72 ч показали, что в этих препаратах также содержится гаптен (см. табл. 2). Например, к рецептору 0-4

2,5Ъ, а к рецептору 0-12 2,5%.

Аналогичные исследования О-антигенов мышиного тифа, паратифа A и паратифа В, полученных методом дезин.35 теграции бактерий фагон (фаголиэат) и ультразвукового О-антигена из этих же штаммов (см. табл. 2) показали, что в них гаптены не содержатся.

Использование предложенного споЩ соба позволит оценивать качественное и количественное содержание О-гаптенов на уровне отдельных рецепторов и таким образом сравнивать и отбирать лучшие методы получения О-антигенов. д Этот способ создает возможность в лабораторных условиях оценивать за короткий срок (несколько часов) не только препараты, но и методы их производства. Таблица 1 рюшнотифоэ ных анти ге нах

784872

Т а б л и ц а 2

Исследование гаптенов в антигенах мышиного тифа, полученных с помощью гидроксиламина при 57 С в течение 72 ч..

Наименование препарата и Р серии

Сенсибилизирующая доза препарата на 1 мл .2,5Ъ эритроцитов

Обратные титры .сывороток s

РПГА и рецепторам

Содержимое гаптена к рецепторам, Ъ

4 12

Г"

Ультразвуковой Т.N. (контроль) 100

320

100

320

2,5

100

160

2 5

160

2,5

100

160

2,5

160

2,5

С-2

100

160

2 5

R-8

100

320

Ультразвуковой антиген мышиного тифа серия 2 неактивированный

Нет Нет

Нет

100

Нет

О-антиген фаголизат мышиного тифа ТбилНИИВС серия 2

100

Нет

Нет Нет

Нет

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что сенсибилизирующая доза исследуемого антигена в 1020 раз превышает сенсибилиэирующую дозу референс-гаптена.

Формула изобретения

1. Способ определения гаптена в антигене, отличающийся тем что, с целью количественного определения гаптена на уровне отдельных рецепторов, эритроциты параллельно сенсибилизируют исследуемым антигеном и референс-гаптеном, затем определяют их специфическую актив- 40 ность в реакций пассивной гемагглютйнации и по разности показателей специфической активности определяют количественное содержание гаптейа в антигене, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Hi)net К.C. and an. "Структура и биологические свойства поверх-. ностных антигенов арамотрицательных бактерий". j. Bacterfalogy Reveiw

1963, 27, 4,, р. 352-368.

Составитель С. Малютина

Редактор П. Горькова Техред T.Èàòî÷êà Корректор Л. Иван

Заказ 8699/3 Тираж 67.3 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Т-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4