Способ получения препарата бактериальной люциферазы

Способ получения препарата бактериальной люциферазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

И E

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сеюз Советскик

Сев,иалистическик

Республик

<1>785318

К АВТОРСКОМУ СИИ ЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 26. 01. 79 (2! ) 2719553/23-04 с присоединением заявки йо (23) Приоритет

Опубликовано 071280. Бюллетень Мо 45 (я)М, К„.3

С 07 G 7/02

Государствеииый комитет

СССР по делам изобретеиий и открытий (53) УДК577.15..07(088.8) Дата опубликования описания 081280 (72) Авторы изобретения

В. Н. Шумихин, Ю. А. Малков, В. С. Данилов и Н. С. Егоров

Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М. В. Ломоносова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БАКТЕРИАЛЪНОЙ

ЛЮЦИФЕРАЗЫ

Изобретение относится к медицинской, микробиологической и ферментной промышленности и может быть при менено в биохимии, медяцине, микробиологии и аналитической химии для 5 определения содержания флавинов, пиридиннуклеотидов, никотинамидлдениндинуклеотид (НАД)-зависимых редуктаз, альдегидов и кислорода.

Известен способ получения препара- !О та бактериальной люциферазы, включаюций выращивание культуры Photobacterium fischeri на жидкой пита-. тельной среде, содержащей источники углерода, азота, кислорода и мине- 15 ральные соли, в аэробных условиях в течение 24 ч с последующим отделением клеток, разрушением их, отделением клеточных оболочек, фракционированным осаждением белков высалива- Я нием сульфатом аммония при насйцении

30-75к, отделением осадка фермента, растворением его в буфере и очнсткой его путем колонной хроматографии в присутствии буфера на сефадексе G-75 25 и диэтиламиноэтилцеллюлозе (ДЭАЭ-32) и диэтиламиноэтилсефадексе (A = 50)(й.

Недостатками этого способа являются относительно низкая удельная активность получаемого препарата люциферазы при реакции с восстановленными формами флавинмононуклеотида и никотинамиддину:<леотида удельная активность составляет: FNNHg.

90 10 " квант с мг, йАОН 03

10" квант с . мг .

Цель изобретения — увеличение удельной активности препарата люциферазы.

Цель достигается тем, что в способе получения препарата бактериальной люциферазы выращивание культуры проводят в течение 9-11 ч, разрушение клеток осуцествляют обработкой их детергентом в количестве 0,5-1,0% от веса биомассы и действием ультразвука, осаждение люциферазы сульфатом аммония осуществляют при насыщении 78-80%, проводят диализ íà сефадексе растворенного в буфере осадка фермента, а в качестве анионообменника при хроматографии используют триэтиламиноэтилцеллюлозу, полученный элюат пропускают через колонку с сефадексом и лиофилизуют.

Предлагается способ получения пре парата бактериальной люциферазы, заключаюцийся в выращивании культуры ,Photobacterium fischeri на жидкой питательной среде, содержащей источ785318 оль ктатдегидронаэа

- В

d0 ники углерода, азота, кислорода и минеральные соли, в аэробных условиях в течение 9-11 ч, отделении клеток, разрушении их обработкой детергентом в количестве 0,5-1,0 от веса риомассы и действием ультразвука, отделении клеточных оболочек, фракцио- . нированном осаждении белков сульфатом аммония, причем осаждение люциферазй проводят ВрН насыщении (ИН4 ) S04

78-80%, полученный осадок фермента растворяют в буфере и подвергают диализу и хроматографии на сефадексе и триэтиламиноэтилцеллюлозе в присутствии буфера, а полученный после хроматографии элюат пропускают через колонку с сефадексом G = 25 и лио- 3$ филизуют.

При выращивании культуры обычно используют среду следующего состава вес. Ъ: йа НР04. — 0,7-1,0, КН РО, 0,1-0,2; (NH4) HPO 0,05-0,07; HgS04 Ю

0,01-0,02; пептон 1,0-1,5; NaCI

28-33, остальное дистиллированная вода.

В качестве детергента обычно используют Triton Х=100.

Диализ растворенного осадка люциферазы, полученного при высаливании, обы но проводят на сефадексе

G=10.

Хроматографическую очистку на сефадексе обычно проводят с исполь- З0 зованием сефадекса G=75.

При осуществлении хроматографии на триэтиламиноэтилцеллюлозе обычно . используют К/Na-фосфатный буфер, рН 7,0, причем элюцию проводят гради- 35 ентом в интервале концентраций О0,5М в указанном буфере.

Полученный препарат обладает удельной активностью 1700 1 квант с мг 1 (FHNHg,) и 57 ° 10 квант 4() с мг (NADH) и степенью очистки.соответственно 525 и 1250 раз °

Полученный по предлагаемому способу препарат позволяет измерить значительно меньшие количества пиридиннуклеотидов, флавинмононуклеотида и,НАД-зависимых редуктаз, напри мер лактатдегидрогеназы, по сравне- нию c ïðåïàðàòàìè,êîòîðûå получены известным. способом (см. таблицу). ,SO

-Ж -36

Прототип 10 10

ПРедлага 47 «1 9 емый 10 10

Пример 1 ° Культуру Photobacterium fischeri, растущую на твер дой, среде следующего состава, вес.Ъг морская вода 38, пептон 1, МПВ 6, гар-агар 2, дистиллированная вода остальное, высевают в жидкую среду состава, вес. Ъ: Ма2НРО4 0,7; КН РО4

0,1; (ЙН4) НР04 — 0,05; HgSO4 0,01; пептон 1; NaC1 28, дистиллированная вода остальное, через 11 ч 200 мл культуры стерильно переносят в ферментер емкостью 10 л с той же самой средой и осуществляют ферментацию в течение 9 ч при контроле и поддержа нии постоянными рН среды (7,0) и уровня растворенного кислорода (10% от насыщения) при 17 С. Но окончании ферментации клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугиро ванием при 25000gx30 мий, и разрушают лизисом в К/Nа-фосфатном буфере

0,02 М, рН 7,0, с дитиотриетолом (ДТЕ) с помощью Тг!акоп Х-100 в качестве детергента в количестве 0,5% от веса клеток в течение 40 мин при

17 С с последующей обработкой ультрао звуком 22 кГц х 3 мин (l О, б А, прибор УДЗ-1). Буфер добавляют в соотношении 4:1 (объем/вес. клеток). Крупные частицы клеток удаляют центрифугированием при 105000g х 1 ч, затем провадят дробное осаждение белков сульфатом аммония: первая часть белков, неактивных, осаждают при насыщении 25%, раствор центрифугируют при 105000g х 1 ч, осаждают активную часть белков при насыщении 80% и центрифугируют в тех же условиях.

Вся люцифераза высаливается при насыщении 80Ъ, этот осадок растворяют в 150 мл К/йа-фосфатного буфера (состав тот же) и наносят на колонку с сефадексом G=10 для быстрого диализа, затем активную фракцию наносят на колонку с сефадексом G=75 для окончательного диализа и очистки от балласта низко- и высокомолекулярных соединений. Полученный препарат наносят на триэтиламиноэтилцеллюлозу высокоэффективный анионообменник с хорошими фильтрационными характеристиками. Вся активность люциферазы связывается с ионообменником, снятие с него осуществляют градиентом NaCl в интервале концентраций 0-0,5 М с помощью системы, позволяющей регули; ровать развертывание градиента в зависимости от сигнала детектора УФпоглощения на выходе колонки, что дает возможность значительно улучшить хроматографическое разделение. Полученный препарат бактериальной люциферазы диалиэуют на колонке сефадекса G-25 для удаления NaCi и перевода фермента в летучий буфер — триэтиламин - HCI 0,01 М, рН 8,8, а затем лиофилизуют. Окончательный продукт имеет степень очистки в 500 раз по активности с FHNH> и в 1100 раз по активности с NADH и удельную активность 1750 10" и 55 10 квант с мг . Он стабилен при хранении при 0-4 С в течение нескольких меся6

785318

Murphy, G. J. Fa"Bacter i a l В ioluApplication to

res",In "Liquid

ing", New York, с., 1974, р. 4031. J. Lee, С.

inl, Т. L. Baucom, minescence and its

Ana1ytiса1 Procedu

Scintilation Count

Academic Press, In

420 (прототип ).

Формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Ыедакто 3. Бородкина Техред tA.À÷ Корректор М. Шароши

Подписное

Заказ 8754 25 Тираж 495

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб. д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгааол ул. Проектная, цев и гомогенен при SDS-электрофорезе в IIAle.

tl р и м е р 2. Культуру Photobacterium fischeri, растущую на твердой среде следующего состава, вес.%: морская вода 38; пептон 1; NIIE б; агар-агар 2; дистиллированная вода остальное и высевают в жидкую среду состава,вес.%: . йайг. РОц 0,2; (ЙНФ)2НР4

0,07; И9504 О, 02; пептон 1,5; NaC I

33, дистиллированная вода остальное, через 14 ч 200 мл культуры стерильно переносят в ферментер на 10 л с той же самой средой и осуществляют ферментацию в течение 11 ч при контроле и поддержании постоянными рН среды (7,5) и уровня растворенного кисло- 15 рода (40%) при 23 С. По окончании ферментации клетки отделяют центрифугированием при 25000g х 30 мин и разрушают лизисом в К/Na-фосфатном буфере 0,1 М, рН 7,4, с ДТЕ с помо щью Triton-X-100 в количестве 1% от веса клеток в течение 1 ч при

23 С с последующей обработкой ультразвуком 35 кГц х 2 мин (1 0,4 А, прибор удз-1) ° Буфер добавляют в соот- 25 ношении б:1 (объем/вес клеток). Крупные частицы клеток осаждают центрифугированием при 105000g х 1 ч, затем проводят осаждение л оциферазной активности сульфатом аммония, как в примере 1. Полученный осадок растворяют в 200 мл К/Na-фосфатного буфера того же состава и наносят на колонку с сефадексом G-10 для диализа, затем хроматографируют на сефадексе

G-75, окончательную очистку проводят на триэтиламиноэтилцеллюлозе.

Люциферазу элюируют с ионообменника градиентом. NaCI, активность сходит в районе 0,4 М. Полученный препарат диализуют от соли, переводят @) в летучий буфер — триэтиламин -НСI

0,02 М и лиофилизуют. Окончательный продукт имеет степень очистки в 540 раз по активности с FMNH< и 1300 раз по активности с ЙАОН и Удельную ак- 45 тивность 720 10" и 58 ° 10 квант с-t, мг-I соответственно. Препарат гомогенен при SDS-электрофорезе в

ПАГе и стабилен при хранении при

0-4 С в течение нескольких месяцев.

1. Способ получения препарата бактериальной люциферазы, включающий вы- 55 ращивание культуры Photebacterium

f i s c he г i на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, кислорода и минеральные соли, в аэробных условиях, отделение клеток, нх разрушение, отделение клеточных оболочек, фракционированное осаждение белков сульфатом аммония, отделение эсадка люциферазы, растворение его в буфере и колонную хроматографию на гефадексе и анионообменниках в присутствии буфера, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения удельной активности препарата, выращивание культуры проводят в течение

9-11 ч, разрушение клеток осуществляЙт обработкой их детергентом в количестве 0,5-1,0 от веса клеток и действием ультразвука, осаждение люциферазы сульфатом аммония осуществляют .при насыщении 78-80%, проводят диализ на сефадексе, а в качестве анионообменника при хроматографии используют триэтиламиноэтилцеллюлозу, полученный элюат пропускают через колонку с сефадексом и лиофилизуют.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что при выращивании культуры используют жидкую питатель-. ную среду следующего состава, вес.%:

Ма НРО4 О, 7-1, О; КН РО О, 1-0, 2; (МН4) НР04 О, 05-0, 07; MgS04 О, 01-0, 02 пептон 1,0-1,5, NaCI 28-33, остальное дистиллированная вода.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве детер- гента используют Triсоп Х-100.

4. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что диализ проводят на сефадексе G-75.

5. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что для хроматографии используют сефадекс G-75. б. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что хроматографию на триэтиламиноэтилцеллюлозе осуществляют в условиях К/Na-фосфатного буфера, рН 7,0, с элюцией градиентом NaCI в интервале концентрацией 0-0,5 М в указанном буфере.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе