Способ получения биомассы микроорганизмов

Способ получения биомассы микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

4&+g

О П И С А ИИ.В

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союэ Советсиик

Социалистических

Республик

К HAl ЕВТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 23. 06. 77 (21) 2497850/28-13 (23) Приоритет — (32)— (51)М, Кл.

С 12 0 13/06

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (33)— (31) Опубликовано 071280.Бюллетень Hо 45

Дата опубликования описания 071280 (53) УДК 668. 392 (088.8) Иностранцы

Мичихико Нодэири, Кацуо Какутани, Сигезо Уедоно, Кацуо Уенакаи и Масафуми Мацумото (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Мицуи Инджиниринг Энд Шипбилдинг Компани Лимитед" (Япония) (71) Заявитель (5 4 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Б HOMACCbl

МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к микробио логической промышленности и включает . способ получения биомассы путем культивирования микроорганизмов на крахмалсодержащем сырье, предварительно разжиженном и гидролиэованном c помощью амилолитических ферментов.

Известен способ разжижения крахмалсодержащего сырья с помощью де. кстриногенных амилолитических ферментов (1).

Полученное разжиженное сырье после гидролиза может быть использонано для культивирования микроорганизмов. !5

Наиболее близким к изобретению техническим решением является способ получения биомассы микроорганизмов, предусматривающий ферментатинный гидролиэ крахмалсодержащего сырья, 20 ныращиэание дрожжей и отделение биомассы (2).

Недостатком известного способа является невысокий выход биомассы в процессе выращивания микроорганиэ- 25 мов.

Цель изобретения — увеличение выхода биомассы.

Поставленная цель достигается тем, что перед ферментативным гидролизом 30 крахмалсодержащее сырье разжижают путем добавления декстриногенного ферментами„-1-4-глюкан-4-глюкан-гидролазы, полученной из Bacillus

subtilis чаг Biotecus, а выращивание дрожжей осуществляют. непосредственно в процессе ферментативного гидролиза сырья, причем культивируют дрожжи нидов Candida utilis или

Rhodotorula graciIls.

Способ осуществляют следующим образом.

Микроорганизмы утилиэируют монои олигосахариды. Высокомолекулярные углеводы, к числу которых относится крахмал, перед выращиванием микроорганизмов гидролизуют с помощью амилолитических осахаривающих ферментов и получают смесь сахаров.

Эту смесь используют в качестве источника углерода. Интенсивность гидролиэа крахмала нозрастает, если крахмалсодержащее сырье перед гидролиэом подвергают разжижению амило литическими декстриногенными Жермен. тами.

В качестве сырья используют различные растительные источники крахмала, предпочтительно картофельный

786917 нии рН среди 4 0-7 0 температура

30-4 5

Выращивание осуществляют периодическим и непрерывным способом в несколько стадий на установке, состоя,щей из нескольких Ферментеров, соединенных последовательно. крахмал или отработанную жидкость с предприятий производства крахмала.

Сырье, содержащее крахмал, маниок или другие сорта картофеля, измельчают, просеивают и смешивают с водой до определенной концентрации крахмала в смеси. При использовании в качестве сырья отработанной жидкости с предприятий производства крахмала из сырья предварительно извлекают белок известными способами; рН суспензии крахмала доводят,до определенной величины и дббавляют в нее декстриногенный фермент <А.-1-4-глюкан-4-глюкангидролазу. Фермент подается непрерывно в аппараты для двухстадийного разжижения. При этом 15 о смесь нагревают до температуры 85-88.

Продолжительность процесса разжижения составляет от 60 до 90 мин.

Разжиженная масса раэбавляется водой до содержания сахара 1-8%, 20 предпочтительно 4%. Затем в смесь добавляют необходимые количества неорганических питательных солей, содержащих азо-, фосфор, магний и калий. доводят рН полученной питательной срецы до 4,6-6.

В качестве источника азота используют одно или несколько неоргани- 1 ческих соединений: сульфат аммония, фосфат аммония и нитрат аммония. В некоторых случаях используют органический азот в виде мочевины. В качестве других источников питания микроорганизмов используют дигидрофосфат калия, гидрофосфат натрия, сульфат магния, а также сульфат двухвалент- 35 ного железа. Полученную питательную среду стерилиэуют.при температуре

120-135 под давлением в течение 1060 мин.

Стерильная питательная среда по- 40 ступает в ферментеры и инокулируется

Микроорганизмами: дрожжами,. бактериями или другими микроорганизмами, предпочтительно дрожжами рода

Candida, синтезирующими белок,или g$ дрожжами рода Rhodotorula, синтези рующими предпочтительно липиды,Одновременно с инокулятором в ферментеры добавляют необходимое количество сахарогенной амилаэы, предпочтительно глюко-амилазы, Фермент добавляют в стерильных условиях. В ферментере проходит одновременно осахаривание разжиженного крахмала и рост микроорганизмов. Микроорганизмы используют для роста образующиеся глюкозу и маль . тоэу.

Раствор сахарогенной амилазы

Ylucuzyme и (фирмы "Амано Сейияку", Япония) стерилиэуют пропусканием через микройильтр с размером пор около 0,2 мк, например фильтр ЕХ

Hillipore фирмы "Миллипор Корп", С1ПА. Затем амилазу подают в среду.

Выращивание микроорганизмов проводят в аэробных условиях при перемешива- Я

Время выращивания дрожжей в питательной среде, содержащей разжиженный крахмал, который непрерывно осахаривают сахарогенной амилазой, составляет 14-21 ч. Биомассу отделяют от среды сцеживанием или центрифугированием. Затем биомассу сушат. Выход биомассы составляет 45-52Ъ от .введенного сахара. Количество неиспользованного сахара составляет 0,10,25.

На фиг.1 представлена технологическая схема предлагаемого способа, на фиг.2 и 3 — примеры реализации стадии ферментативного осахаривания и выращивания культур.

Способ включает следующие технологические стадии: предварительная подготовка исходного сырья 1> ферментативное разжижение крахмала 2, получение питательной среды для выращивания культуры 3, стерилизация питательной среды 4, Ферментативное осахаривание и выращивание культуры

5, отделение микробных клеток б, сушка 7 и получение готового продукта 8.

Установка для ферментации (см. фиг.2) содержит три ферментера 9-11, расположенные последовательно.

Объем третьего ферментера в два раза больше объема первого или второго ферментеров. Среда для выращивания культуры поступает через трубопровод 12, а сахарогенная амилаза через трубопровод 13. Три ферментера последовательно связаны при помощи трубопроводов 14 и .15. Часть среды для выращивания культуры возвращается из второго ферментера в первый через трубопровод 16. Количество возвращаемой среды определяется скоростью роста используемых микроорга-. низмов, эффективной емкостью ферментеров, концентрацией микроорганиз-, мов, а также концентрацией и количеством среды для выращивания, поступающей в ферментеры.Часть среды для выращивания культуры из второго ферментера возвращается в первый для того, чтобы привить в первом ферментере культуру микроорганизмов с высокой скоростью роста. Этим добиваются стабилизации концентрации микроорганизмов в первом ферментере.При этом, предотвращается возникновение явления так называемого,"вымывания" клеток, если в первый ферментер будет поступать большее количество среды для выращивания культуры. В непрерыВном многостадийном процессе

786917 выращивания возврат среды осуществляется из последнего аппарата.

В непрерывной системе трехстадийного выращивания, в первом ферментере наблюдается рост активности микроорганизмов и ускорение процесса осахаривания. Во втором ферментере находятся микроорганизмы н логарифмической фазе роста. В третьем аппарате микроорганизмы находятся в стационарной Фазе роста.

Благодаря ассимиляции сахара в последнем ферментере значительно снижается биологическая потребность в кислороде отработанной водной средыУстановка для ферментации (см. фиг.3) состоит также из трех Ферментеров 17-19, расположенных последовательно, как и в установке, представленной на AHI .2, но со значительно улучшенными показателями процесса ферментации.

Процесс выращивания аэробных микроорганизмов требует аэрации среды.

Это приводит к образованию обильной пены. Кроме того, меласса, отработанный раствор крахмала или отработанные эффлюенты пищевой промышленности содержат вспенивающие вещества, вызывающие обильное образование пены.

Поток жидкости из первого Ферментера во второй или поток жидкости из второго ферментера в третий содержат пену и пузырьки воздуха, что делает этот пбток нестабильным. Колебания скорости потока и скорости разбавления в известных системах непрерывного действия с перетоком или системах с рециклом приводят к нарушению развития микроорганизмов и нежелательному снижению выхода продукта.

Установка для ферментации, показанная на фиг.3, предназначена для преодоления пенообраэования. Она отличается тем, что между первым,вторым и третьим Ферментерами поддерживается перепад давления. Процесс непрерывного выращивания аэробных микроорганизмов протекает спокойно.

Уровень жидкости в Ферментерах легко балансируется регулиронанием пере-.,пада давления Р„ и Р в ферментс >ах

17 и 18 и Р и Р. в ферментерах 18 и 19. Если уровень жидкости в первом аппарате начинает повышаться иэ-за сильного образования пены, его можно снизить при помощи небольшого увеличения уровня давления Р„ . При этом, одновременно несколько увеличивается давление Р и Р > .Этим добиваются стабильного протекания непрерывного выращивания культуры.

Ферментеры. связаны между собой трубопроводами 20 и 21. Исходный материал загружают через вход 22 в первый ферментер. Воздух подают через трубопровод 23 в каждый аппарат

45

-ных солей, рН доводили до 4,4-5

:Полученную среду для выращивания б5 культуры непрерывно стерилизовали

1Î

55 бО и выходит через отверстие 24. В пер" ном ферментере поддерживают давление

1000-2500 мм водяного столба, во вто. ром 600-1800 мм .водяного столба и в третьем 300-1500 мм водяного столба.

Если необходимо, давление н первом ферментере можно поднять выше

2500 мм вод.столба.

Небольшое повышение давления в аппаратах увеличивает скорость переноса кислорода, что приводит к увеличению скорости роста микроорганизмов и увеличению производительности процесса.

При непрерывном выращивании дрожжей рода Candida н среде, содержащей неорганические питательные соли и источник углерода, приготовленный из сельскохозяйственных продуктов, в установке для ферментации, представленной на фиг.3, выход биомассы составляет 50% и более в пересчете на общие затраты сырья.

Биомассу отделяют от отработанной среды сцеживанием, затем концентрируют на центробежном сепараторе с жиклером или на других сепараторах.

Далее биомассу высушивают на распылительной сушилке, бараб-нной сушилке или в аппарате мгновенного испарения. В некоторых случаях можно использовать сушки специального типа с целью получения продукта в виде гранул или таблеток. Способ позволяет обрабатывать большие количества исходного материала н течение короткого промежутка времени.

Процесс выращивания микроорганизмов протекает спокойно. Контроль за течением процесса осуществляется автоматически. Можно перерабатывать исходный материал высокой концентрации.

Так как ферментативное осахаривание и выращивание микроорганизмов осуществляется одновременно, то в дополнительной емкости для осахаривания нет необходимости. Предварительное разжижение способствует увеличению скорости гидролиэа. Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 . Корни маниоки (тапиока) измельчали и разбавляли водой до образования кашицы с содержанием крахмала примерно 16%, рН кашицы доводили до 6,0-6,2, добанили декстриногенный фермент (Спитаз К, фирма Нагаэе Индастриэл

Корп, Япония) в количестве 0,2% в пересчете на содержание крахмала.

Кашицу непрерывно раэжижали при температуре 85-88 С. После удаления примесей разжиженный раствор разбавляли водой до концентрации сахара

1,5-6Ъ.

В раствор добавляли необходимое количество неорганических питатель 86917 нагреванием в стерилизаторе, а затем подавали в первый ферментер.

Среду инокулировали культурой

Candida utilis. Одновременно и непрерывно в среду для выращивания с заданной скоростью добавляли в стерильных условиях сахарогенную амилазу.

Общее время выращивания составило

4-8 ч.

Биомассу отделяли при помощи центрифуги и высушивали. Выход сухих микробных клеток составил 45-53% в пересчете на содержание крахмала в тапиоке.

Пример 2. Корни маниоки (тапиоки) обрабатывали и разжимали тем же способом, что описан в примере 1. Разжиженный раствор разбавляли водой, так чтобы содержание крахмала составляло 4Ъ. В раствор добавляли необходиМое количество неорганических солей, таких как неорганические соединения азота, фосфора, калия и другие. Раствор стерилизовали при помощи нагревания и непрерывно подавали в ферментер. Среду инокулировали дрожжами Sассhàromусes

cerevislа1. Одновременно в стерильных условиях в среду добавляли

0,3-0,5Ъ сахарогеннрго фермента в пересчете на общее содержание сахара в среде. Время выращивания составило 6-10 ч.

Клетки дрожжей отделяли,концентрировали и сушили. Выход клеток дрожжей составил 45-50Ъ в пересчете на вес крахмала.

Пример 3. Отработанный эффлюент с предприятия по производству картофельного крахмала (содержание сухих веществ около 8, содержание растворимых веществ, не содержащих азота, 3-4%) обрабатывали для получения рН, равного б. Затем массу разжижали добавлением заданного количества раажижающего фермента.

Затем в раствор добавляли необходимое количество неорганических питательных солей и получали. среду для выращивания культуры. Среду стерилизовали нагреванием и непрерывно подавали в ферментер. Выращивали дрожжи рода Candida. В среду в стерильных условиях с заданной скоростью непрерывно добавляли сахарогенную амилазу. После выращивания клетки дрожжей отделяли от среды, концентрировали и сушили. Около 45% растворимых, не содержащих азота, веществ переходили в клетки дрожжей.

Пример 4. Сырые корни маниоки обрабатывали и разжижали по аналогии с примером 1. Разжиженный раствор разбавляли так, чтобы концентрация сахара составляла 2-5%. В раствор добавляли необходимые неорганические соли. В полученной среде для выращивания культуры соотношение концентрации C/Ö составляло 20-.4O:1.

Среду стерилизовали и подавали в ферментер. Осуществляли периодическое или непрерывное выращивание дрожжей, рода Rhodotorula, которые продуцируют липиды. Одновременно в стерильных условиях в среду добавляли с заданной скоростью сахарогенную амилазу. После отделения и концентрирования биомассу высушивали.

Выход сухих клеток составил 40-48% в пересчете на содержание крахмала в сырой маниоке. Содержащие липидов в сухих клетках дрожжей составило

15-50%.

Липид имели состав, аналогичный составу растительного масла. Кроме

35 того, остаток, образовавшийся после извлечения липидов, представлял собой массу, богатую белками.

Пример 5. Непрерывное выращивание микроорганизмов проводили

20 на установке для аэробной ферментации, представленной на фиг.3. Давление в первом ферментере составляло

1800 мм водяного столба, во втором—

1500 мм водяного столба и в третьем

1000 мм водяного столба. Интенсивность аэрации была в первом ферментере 0,5 об/об мин, во втором—

1,0 об/об.мин и 0,5 об/об.мин — в третьем ферментере.

Общий объем первого, второго и третьего ферментеров составлял

500 л, 500 л и 1000 л, соответственно. Объем среды для выращивания культуры составлял 300 л, 300 л и

600 л соответственно. Скорость подачи среды была 250 л/ч. Использовали дрожжи Candida genus. Среда для выращивания культуры содержала следующие неорганические соли: NH NO3- б r.

КНгРО, - 3 r, МагНРО4.12Н О вЂ” 0,5 г, 4Q MgSO4 ° 7НгО 0 ° 5 r°, FeS O 0 ° 5 r, водопроводная вода — 1000 мл, рН 5,5.

В качестве источника углерода использовали раствор, полученный измельчением и разжижением сырого сладкого

g$ картофеля, который добавляли в среду так, чтобы концентрация глюкозы была 4Ъ, рН среды поддерживали на за-. данном уровне при помощи йН ОН. Длительность непрерывного выращивания

gp в три стадии составляла 500 ч. Выход биомассы был 50% в пересчете на источник углерода, а скорость роста дрожжей равнялась 0,6 ч- .

Пример б. Для выращивания культуры использовали среду, состав которой приведен в примере 5. В качестве источника углерода в среду добавляли мелассу с концентрацией 4% (в/в) в пересчете на сахар. Осуществляли непрерывное выращивание штамма

dp дрожжей Candida utilis. В первом, втором и третьем ферментерах поддерживали давление 2500 мм вод.столба (Р„), 2000 мм вод.столба (Р г) и

2500 мм вод.столба (Р3) соответствен65 но. При этом интенсивность аэрации

786917

Формула изобретения

20

/б

ВНИИПИ Заказ 8892/66 Тираж 522 Подписное

Филиал ППП Патент, г, ужгород, ул. Проектная, 4 были 1,0 об/об мин, 1,0 об/об -мин и 0,5 об/об мин соответственно. Непрерывный способ выращивания н три стадии осуществляли с использованиеМ установки для ферментации, представленной на фиг.3.Размеры ферментеров и количество среды, загружаемой в каждый, аналогичны размерам и количествам, приводимым в примере 5.Непрерывное выращивание осуществляли в течение более 300 ч. Выход микробных клеток составил 52Ъ в пересчете на содержание сахара.

Пример 7. Для выращивания культуры использонали неорганическую среду, имеющую состав, аналогичный приведенному в примере 5. В качестве 35 источника углерода использовали отработанный раствор картофельного крахмала. Выращивали культуру Candida

utt1is. Источник углерода имел концентрацию 4%. 20

Непрерывное выращивание протекало при тех же условиях, что описаны в примере 6, в течение 400 ч и более беэ каких-либо трудностей, вызванных загрязнением среды другими микроорганизмами. Выход микробных клеток составил 48Ъ в пересчете на концентрацию сахара. Содержание белка в микробных клетках составило 46-52il.

Пример 8. В качестве источника углерода использовали мелассу. ЗО

Выращивали дрожжи Rhodotorula

gracilis, нырабатывающие липиды.

Концентрация источника углерода составляла. 4t (в/в). Неорганическая среда для выращивания содержала 35

75 мг/л мочевины и 25 мг/л КН2РО, рН среды было равно 5,0.Интенсивность аэрации составляла 5,0 об/об мин.

Непрерывное выращивание дрожжей ocy- ществляли при температуре 32 С. Среду перемещали со скоростью 200 об/мин.

Выращивание проводили на установке для ферментации представленной на фиг.3.В первом, втором и третьем ферментерах поддерживали давление, мм вод.столба: 1200, 800 и 500 соответственно. В результате непрерывного процесса выращивания в течение

250 ч содержание липидон достигало

39,6% в пересчете на сухие клетки дрожжей.

1. Способ получения биомассы микроорганизмов, предусматривающий фер«. ментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья, выращивание дрожжей и отдельные биомассы, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью увеличения выхода биомассы, перед Ферментативным гидролиэом крахмалсодержащее сырье разжижают путем добавления декстриногенного фермента (-1-4-глюкан-4-глюкан-гидролазы, полученной иэ Bacillus subtilis чаг Biotecus, а выращивание дрожжей осуществляют непосредственно в процессе ферментативного гидролиза сырья.

2. Способ по п.1, о т л и ч à n— шийся тем, что культинируют

apovmv a oa Cand i da u t i l i s или

Phodotorula gracilic.

Источники информации, принятые но внимание при экспертизе

1. Патент CHEAP ll 3149049, кл. 195-31, опублик.1964.

2. Патент Франции 9 2285080, кл. С 12 0 13/06, опублик.1976 (прототип).