Способ получения фосфодиэстераз

Способ получения фосфодиэстераз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИГРАНИ Е

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалис тически к

Республик

787413

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свил-ву (22)Заявлено 27 11.78(21) 2713520/ 8-13 (51)М. Ê I.

С 07 б 7/02 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет

Государственный комитет

Опубликовано 15.12.80. Ьюллетень № 46 (53) УДК 615 779 . 94(088. 8) оо делам изобретений и открытий

Дата опубликования описания 18.12,80 (72) Авторы изобретения

И. l1. Батурина, Г. l1. Бердышев и Н. A. Луценко

Киевский ордена Ленина государственный университет им. Шевченко (7I) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОДИЭСТЕРАЗ!

Изобретение относится к мецицинской промышленности и касается получения биологически активных веществ, которые могут найти применение в метицине в качестве терапевтических средств.

Известен способ получения фосфоди-

5 эстераз путем гомогенизации исходного сырья с последующим отстаиванием гомогената, цекантированием образовавшейся надосацочной жидкости, содержащей фер- .. ментный белок, и высаливанием целевого

10 продукта сульфатом аммония $1).

Однако фермент, полученный данным способом, обладает недостаточной актив15 н остью. т.!елью изобретения является повышение активности ферментов и.расширение сырьевой базы.

Эта цель достигается тем, что в качестве сырья используют DTKogbI внутрен- . них органов рыб, а высаливание целевого процукта ведут при концентрации сульфата аммония 30-80%.

I

П р и м .е р 1. Получение 5 -фосфодиэстеразы нз внутренних органов карпа. Внутренние органы рыб, включающие печень, кишечник, сердце, селезенку, молоки и т. п.„используют сразу же после извлечения из рыб или хранят в замороженном вице до употребления (вплоть до

6 мес. беэ потери биологической активности). Все операции по выделению

5 -фосфоЪиэстеразы проводят на холоду

04 С.

100 г свежеполученнбй (или замороженной) ткани внутренних органов рыб измельчают в гомогенизаторе (например марки PT-1; 2000 об/мин; 3 мин) в

150 мл холодной дистиллированной воды.

После измельчения ткани добавляют еще

150 мл дистиллированной воды и по каплям вводят 0,4 М серную кислоту (25 мл) до конечной концентрации ее в растворе О,025 М, При этом рН гомогената снижается цо 3. Экстракцию ферментных белков осуществляют встряхиванием гомоГената с кислотой в течение

7874

4-5 ч на механической качалке, либо отстаиванием его в течение 3-х сут при

2-4 С. Выход ферментных белков при о двух способах экстракции одинаков, но фосфодиэстеразная активность в первоМ случае выше. В ходе экстракции в описанных условиях (рН 3; 0,025 М серной кислоты; температура 0-4 С) резко

О снижается активность фосфомоноэстеразы и происходит денатурация сопутствующих (балластных) белков, что способствует очистке целевого продукта.

После окончания экстракции гомогенат центрифугируют (например на центрифуге ИЛР-1 при 2500 об/мин, 30 мин) или фильтруют на воронке Бюхнера для удаления обрывков ткани, субклеточных структур и денатурированных белков.

Осацок отбрасывают, а из прозрачной нацосадочной жидкости проводят дробное фракционирование (высаливание) белков сернокислым аммонием. Высаливание проводят на холоду (2-4 С), постоянно пере о мешивая раствор и добавляя соответству

Таблица 1

260

7280 438,6 (28 мгlмл) 60

Гомогенат после центрифугирования

100

Белок после осаждения ANS от 0 до 30% насыщения и обессоливания

300 (5,4 мгlмл) 56

206 2534 1230 (4,1 мгlмл) 58

50, Как вицно из табл. 1, выделение

5 -фосфоциэстеразы предлагаемым способом включает в себя две стации работы (требующие всего 1-3 дн. для завершения) и дает высокий выход целевого продукта, удельная активность которого повышена в 20 раз по сравнению с исходной.

Белок после осаждения AN 5 от 30 до

80% насыщения и обессоливания.

13 4 ющее количество сухого сернокислого аммония. Определение границ высаливания белков, обладающих фосфодиэстеразной активностью, показывает, что они соцержатся во фракции, полученной при насыщении нацосадочной жидкости от

30% до 80%.

Полученный белковый осадок растворяют в минимальном количестве холодной цистиллированной воры (3-6 мл) и обессоливают известным способом, например диализом или гельфильтрацией на колонке, содержащей сефадекс Г-25 или био« гель P-2 или биогель P-6.

Обессоленный раствор фосфоциэстераз хранят в замороженном виде (6 мес без потери биологической активности) или сразу используют цля гидролиза ДНК.

В табл. 1 показано выделение npenat рата 5 -фосфодиэстераз из 100 г внутренних органов рыб, например карпа

С рг1поь Ссц-р1о 4.

Аналогичные результаты получены при

I . выделении 5 -фосфодиэстеразы из 5 Kl внутренних органов рыбы при соответствующем увеличении всех объемов рабочих растворов.

Пример 2. Получение 3 -фосфодиэстеразы из внутренних органов карпа. Все операции по выцелению 3 -фос-!

7874

Таблица 2

7280 380,2 (; 8 мгlмл) 100

260

Гомо гена т после центрифугирования

0,32

1,23

300 (5,4 мг/мл) 56

Еелок после осаждения А%5 от 0 до 30% насыщения и обессоливания

Белок после осаждейия АМЬ от 30 до 80% насыщения и обессоливания.

206 182,4 (4,1 мг/мл ) 900

ВНИИПИ Заказ 8270/23 Тираж 495 Подписное

Филиал ППП Патент,г.Ужгород,ул.Проектная,4

5 фодиэстеразы проводят на холоду при

0-4 С.

100 г внутренних органов рыб (свежеполученных или хранившихся замороженными) гомогенизируют, затем проводят водно-кислотную экстракцию белков из гомогената при рН 3 с последующим высаливанием сульфатом аммония белков, обладающих 3 -фосфодиэкстеразной активностью (30% — 80% насыщения).

Полученный после центрифугирования

Из табл. 2 видно, что выделение препарата 3 -фосфодиэстеразы предлагае1 мым способом включает две стадии работы (требующие 1-3 дн. для проведения), дает высокий выход фермента, удельная активность которого повышена в 18 раз по сравнению с исходной.

Аналогичные результаты получены при выделении 3 -фосфодиэстеразы из 5 кг

1 внутренних органов рыбы при соответствующем увеличении всех объемов рабочих растворов.

Предлагаемый способ позволяет повысить активность целевого продукта. Источник для получения целевого продукта (фосфодиэстераз) - внутренние органы рыб - является бросовым материалом, нигде ранее не использовавшимся. Поэтому он является менее дорогостоящим материалом для получения фосфодиэстеразы, чем в известных способах.

13 б белковый осадок растворяют в минимальном количестве (5-7 мл) холодной дистиллированной воды, обессоливают и хранят в замороженном виде (4-5 мес без потери биологической активности) или сразу используют для гидролиза

ДНК.

В табл. 2 показано выделение препарата 3 -фосфодиэстеразы из 100 г

I внутренних органов рыб, например кар ча С рмпМ Сарово L.

Формула изобретения

Способ получения фосфодиэстераз пу-тем гомогенизации исходного сырья с последующим отстаиванием гомогената, декантированием образовавшейся надосадочной жидкости, содержащей ферментный белок и высаливанием целевого продукта сульфатом аммония, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения активности ферментов и расширения сырьевой базы, в качестве сырья используют отходы внутренних органов рыб, а высаливание целевого процукта ведут при концентрации сульфата аммония 30=

$0 80%

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

$$ М 566589, кл. А 61 К 35/68, 1977.