Способ получения тромболитического фермента

Способ получения тромболитического фермента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И г."""А "Й - И

Союз Советских

Социалистических

Республик

<,>787463

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 26.05. 78 (21) 2622908/28-13 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет—

Опубликовано 151280. Бюллетень Но 46

Дата опубликования описания 171280 (5!)М. Кл.з

С 12 3 13/10

Государственный комитет

СССР оо делам изобретений и открытий (53) УДК 615. 779.. 94 (088. 8) О. К. Гаврилов, Н. С. Мурашова, М. A. Козлова, Л. A.Ñóááîòèíà, Г. В. Андреенко, А.Б. Силаев, P.А. Максимова,Т.Н.Серебрякова и В. М. Русанов (72) Авторы изобретения

Центральный ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови и Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных препаратов.

Известен способ получения тромболитического фермента путем выращивания гриба Тrichotheсium roseum зкстракции сопутствующего антибиотика трихоцетина органическим растворителем с последующим осаждением целевого продукта органическим растворителегл и его очисткой f1)

Однако известный способ не о6еспечивает высокой чистоты препарата, а выход его составляет 500 мг сырца или нативного протеолитического белка — фермента иэ 1 л культуральной жидкости.

Цель изобретения — повышение выхода и чистоты фермента.

Укаэанная цель достигается тем, что целевой продукт осаждают 96 -ным зтиловым спиртом при (-4)-(-7)оС и рН 6,8-7,0, отделяют осадок центрифугированием при (-3)-(-2)оС, затем полученный осадок растворяют в охлажденной апирогенной воде из расчета

1,5-1,55 г на 10-10,5 мл воды и проводят очистку при 0-1 С.

Кроме того,. целевой продукт очищают последовательно осветляющей филь-- 0 трацией, диализом против дистиллированной воды и стерилизующей фильтрацией.

Пример. 100 л культуральной жидкости с активностью 400 мм или

2664 уд.ед/мг после отделения от мицелия помещают в реактор при 20-22 С и экстрагируют затем 4 л хлористого метилена посредством непрерывного перемешивания в течение 10 мин и последующего отстаивания в течение 1 ч.

Экстракт, содержащий антибиотик, удаляется через нижний спуск реактора.

Измеряют объем водного слоя, содержащего фибринолитические ферменты.

Водный слой перекачивают в реактор, который имеет рубашку с рассолом для поддержания рабочей температуры (-4)(-8)o С.

Далее проводят осаждение фибринолитических ферментов трехкратным объемом 96 -ного этилового спирта, предварительно охлажденного до -10оС.

Осаждение проводят при (-4)-(-7) С и рН 6,8-7,0. Выпавший через 3 ч осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2.000-2.500 тыс.об/

/мин на центрифуге с охлаждением до

-3 С. Полученную массу фибринолитических ферментов (1 кг 800 г) растворяют д Ф

Ф 787463

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор М.Дылин. Тех ед Н. Г аб Ко екто В. Б тяга

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва й-35 Ра шСкая наб.

Заказ 8278/25

4 5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 в апирогенной дистиллированной воде (из.расчета 1,5 r осадка на 7,0 мп воды). Раствор подвергают осветляющей фильтрации посредством пропускания его через бумажное тесто под вакуумом. После окончания фильтрации бумажное тесто промывают дистиллированной вбдой (иэ расчета 3 мл воды на 1,5 г осадка) для полного .выхода фибринолитических ферментов иэ бумажного теста в раствор. Фильтрат диализуют в целлофановых мешках марки 250-7и против апирогенной дистиллированной воды в течение 48 ч при

ООC а затем подвергают стерилиэующей фильтрации через фильтры марки

"Миллипор" при величине пор стериллизующей пластины 0,22-0,3 мкм и разливают в пенициллиновые флаконы по

2-3 мл. Разлитый фильтрат замораживают и лиофильно высушивают в течение

24 ч при максимальной температуре подогрева 20 С.

Полученный препарат представляет собой аморфное вещество белого цвета, хорошо растворимое в дистиллированной воде и физиологическом растворе, и является комплексом фибринолитических ферментов.

Применение хлороформа для экстракции антибиотика (из расчета 4 л хлороформа на 100 л культуральной жидкости) не изменяет схемы способа получения тромболитического препарата.

Использование предлагаемого способа выделения фибринолитических ферментов из непатогенных плесневых грибов Tricho".hecium roseum обеспечивает увеличение выхода препарата-сырца в 3,6 ваза. Кроме того, улучшают-. ся тромболитические свойства препарата, которые выражаются в достижении 80-о ополного лизиса экспериментальных тромбов.

В опытах 1n vitro установлено,. что добавление небольших количеств препарата к плазме вызывает быстрый лизис кровяного сгустка. Увеличение концентрации препарата препятствует образованию сгустков. Оптимальная концентрация, способствующая лизису тромбов, равна 15 мг/мл. При изучении ферментативных свойств обнаружено, что препарат обладает способностью активировать плазминоген, Выделенный протеолитический фермент обладает фибринолитической активностью в 3 раза большей, по сравнению с фибринолизином.

Внутривенное введение препарата животным вызывало у большинства из них лизис тромбов в течение 1-9 ч, в то время как в контроле лизис тромбов не отмечался в течение опыта (24 ч). Применение препарата в сочетании с гепарином сокращает сроки

15 лиэиса сгустков в 3-4 раза (возрастает тромболитическая эффективность препарата).

QQ 1. Способ получения тромболитического фермента путем выращивания гриба Trichothecium roseum, экстракции сопутствующего антибиотика трихоцетина органическим растворителем с последующим осаждением целевого продукта органическим растворителем его очисткой, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода и чистоты фермента, целевой продукт осаждают 96 -ным этиловым спирЗ(том при температуре (-4) †(-7) С и о рН 6,8-7,0, отделяют осадок центрифугированием при (-3)-(-2)ОC, затем полученный осадок растворяют в охлажденной апирогенной воде из расчета

35 1,5-1,55 г на 10-10,5 мл воды и проводят очистку при 0-1 С.

2. Способ по и. 1, о т л и ч à юшийся тем, что целевой продукт очищают последовательно осветляющей фильтрацией, диалиэом против дистиллированной воды и стерилизующей фильтрацией.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

45 1. авторское свидетельство СССР

9 446699334488, кл. С 12 9 13/1д, 1973.