Способ определения активности щелочной фосфатазы
Патент 789712
Авторы
Способ определения активности щелочной фосфатазы
Иллюстрации
Реферат
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Союз Советских
Социалистических
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЫЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 06. 07. 78 (21) 2637752/23-04 (51)М. Кл.
G N 21/78
G 01 N 33/50 с присоединением заявки ¹
Государственный комитет
СССР по делам изобретений н открытий (23) Приоритет
Опубликовано 23.1280. Бюллетень ¹ 47 (53) УДК 543. .432(088.8) Дата опубликования описания 25. 12. 80 (72) Авторы изобретения
П. И. Короленко и Л. M. Предеина (i
Гидрохимический институт Государственногочц ми+еса;,:,гидрометеорологии и контроля природной среды ЙСб ! (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ
ФОСФАТАЗЫ
Отличительным признаком способа является использование в качестве субстратао -нафтилфосфата и обработка полученного раствора 4-бензоил20 амико-2,5-диметоксианилином.
Способ иллюстрируется следующим примером.
60 мп oL -нафтилфосфата растворяют в 10 мл дистиллированной воды, 2S нейтрализуют до рН=7,05% раствором бикарбоната натрия и доводят объем раствора де 20 мл. К 0,7 мл приготовленного раствора сС -нафтилфосфата приливают 0,7 мл ОЗМ карбонатно-би-
30 карбонатного буфера рН=10,0 и 0,2 мл
Изобретение относится к аналитической химии,а именно,к способам определения активности щелочной фосфатазы.
Известен способ определения активности щелочной фосфатаэы путем обработки анализируемой пробы раствором и-нитрофенилфосфата в присутствии 1,5-4,5 M раствора солянокислого диэтаноламина с последующим спектрофотометрированием полученного раствора P1) .
Недостатком способа является сложность определения.
Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущностии достигаемому результату является способ определения активности щелочной фосфатаэы, заключающийся в обработке анализируемой пробы субстратом, состоящим иэ глицинового буфера, содержащего хлористый магний и раствора и-нитрофенилфосфата с последующим нагреванием полученного раствора при 37-39оС в течение 30 мин и охлаждением на ледяной бане, добавлением к охлажденному раствору
NaOH и спектрофотометрировании полученного окрашенного раствора (2).
Недостатками способа являются ere сложность и нестабильность окраски конечного фотометрируемого продукта.
Цель изОбретения — упрощение способа и повышение стабильности окрас5 ки раствора.
Поставленная цель достигается описываемым способом определения активности щелочной фосфатазы, заключающимся в обработке анализируемой npol0 бы Q- нафтилфосфатом (субстратом)и
4-бензоиламино-2,5-диметоксианилином с последующим спектрофотометрированием полученного окрашенного раствора.
789712
Предлагаемый способ
Известный способ
Показатели
6>7Ъ
Точность
Чувствительность
6,0
5,3
Объем пробы 2,75 мл.СФ-4А, толщина слоя кюветы 1 см диапазон линейной зависимости от 0 до 0,18 мк. мбль п-нитрофенола
Объем пробы 5 мл.СФ-4А, толщина слоя кюветы 1 см диапазон линейной зависимости от 0 до 0,14 мк. моль Ф -нафтола
-Длительность одного определения
45 мин
45 мин
Устойчивость конечного окрашенного раствора (2-3 суток при хранении в темноте) 15 мин
ВНИИПИ Заказ 9023/36 Тираж 1019 Подписное
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 супернатанта, полученного после центрифугирования гомогена при 7000 об/мин в течение 10 мин. После 30-минутной инкубации при 37 >С приливают О,? мл
2% раствора соли 4-бензоиламино2,5-диметоксианилина и оставляют на
3 мин. За это время происходит связывание образовавшегося в результате ферментативной реакции of нафтила с
4-бенэоиламино-2,5-диметоксианилином
Останавливают ферментативную реакцию добавлением 0,2 мл 20Ъ раствора
Na0H. Затем приливают 1 мл дистиллированной воды и 2 мл ацетона для растворения образовавшегося комплекса о> -нафтола с красителем. Окрашенный раствор фотометрируют при длине волны 530 нм на спектрофотометре.
Активность фермента находят по величине экстинции при помощи калибровочного графика, который строят следующим образом.
В пробирку помещают 2-20 с»: -нафтола, 0,7 мл ОЗМ карбонатно-бикарбонатного буфера рН=10,0, доводят
Известный способ имеет существенный недостаток — нестабильность ко,нечного фотометрируемого раствора и сложность определения.
Основное достоинство предлагаемого способа — получение окрашенного комплекса ef --нафтола с 4-бензоиламино-2,5-диметоксианилином, устойчивого в растворе ацетона в темноте в течение 2-3 суток, что позводяет использовать предлагаемый способ в полевых условиях в качестве экспресс-метода для энзимодиагностики состояния природных вод.
Формула изобретения .Способ определения активности щелочной фосфатазы путем обработки объем до 1,6 мл дистиллированной водой, приливают 0,2 мл 0,2Ъ раствора соли 4-бензоиламино-2,5-диметоксианилина, через 3 мин приливают 0,2 мл
20% раствора NaOK, затем 1 мл воды и 2 мл ацетона. Фотометрируют при 1 =530 «м на спектрофотометре. Активность фермента щелочной фосфатазы выражают в единицах Е/ч, оз«ачающих число микромолей с -нафтола, освобожденного 1 г ткани в течение
1 мин в данных условиях. Рассчитывают активность щелочной фосфатазы по о муле ф р б
15 где А — активность фермента, выраженная. в единицах Е/ч;
С вЂ” концентрация >р — нафтола, освобожденного в результате реакции, выраженная в микромолях.
B таблице приведены сравнительные данные определения щелочной фосфатазы известным и предлагаемым способом. анализируемой пробы субстратом
45 с последующим фотометрированием полученного раствора, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения стабильности окраски раствора, в качестве 0 субстрата используют 0С -нафтилфосфат и полученный раствор обрабатывают 4-бенэоиламино-2,5-диметоксианилином.
Источники информации, SS принятые во внимание при экспертизе
1..Патент Англии Р 1524916, кл. G 01 N 31/14, 1978.
2. Bessey О.А.> Lorwry О.U.
Brock M.l. 1.Вlol. Chem. 1946, 9 1, ц) ре .321 (прототип),