Способ количественного определения хлордиазепоксида в биологических объектах

Способ количественного определения хлордиазепоксида в биологических объектах

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕДЬСТВУ

Союз Советскнх

Соцналнстнческнх

Республнк (ii)792116

* л

,.. У -: (61) Дополнительное к авт. сеид-ву(22) Заявлено 25О978 (21) 2667083/23-04 с присоединением заявки ¹â€” (23) ПриоритетОпубликовано 30,12S0. Бюллетень N9 48

Дата опубликования описания 30.1280 (51)М. Кл З

G N 21/78

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (53) УДК 543.432 (088.8) (72) Авторы изобретения

И.В. Волкова и Б.Н. Изотов

I ф

Первый Московский ордена Ленина и ордена Трудового

Красного Знамени медицинский институт имени И.М. Сеченова (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ХЛОРДИАЗЕПОКСИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ОБЪЕКТАХ

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам количественного определения хлордиазепоксида в биологических объектах.

Известен способ количественного определения хлордиазепоксида, заключающийся в обработке анализируемой пробы буферным раствором до рН среды

7,2 и экстрагировании эфиром, упаривании эфирного экстракта и обработкой полученного сухого остатка глициновым буфером до рН 4,8 и нагревании на кипящей водяной бане с последующей обработкой буфером до рН 7,2 15 и экстракции плактамоэфиром отделением и обработкой эфирного слоя раствором едкого натра, облучением дневным светом и спектрофотометрированием полученного раствора 117. 20 . Недостатком способа является невысокая точность определения.

Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является 25 способ количественного определения хлордиазепоксида в биологических объектах, который заключается в изолировании из гомогенизата объектов исследования 0,1 н раствором соляной 30

2 кислоты (трехкратная мацерация органов), экстрагирование органическими растворителями полученной вытяжки из органов при значении рН, равном

2, эфиром (трижды порциями 25x15x15) с последующим подщелачиванием ее до рН 10 и повторной экстракцией хлороформом из щелочного раствора; хроматографию упаренных экстрактов в тонком слое сорбента, элюирование слоя сорбента, содержащего анализируемое вещество, органическим растворителем; упаривание растворителя, гидролиз 6н-ым раствором соляной о кислоты сухого остатка при 120-130 С, экстракцию полученного гидролизата органическим растворителем, хроматографическое разделение в тонком слое сорбента и элюирование 2-амино-5хлорбензофенола и проведением азосочетания 2-амино-5-хлорбензолфонона с N-d нафтилэтилендиамина дигидрохлоридом и спектрофотометрированием окрашенного продукта f23.

Недостатком способа является его сложность, связанная с многократной зкстракцией, использованием большого количества токсических органических растворителей, применением дв,хкрат792116

IIc) хроГ1,1то" :.).!Фин; длительность (до

2 — х Гу1oK ), невысокая чувствитель ность (граница обнаружения 0,2 мг в

100 г объект,л).

Целью изобретения является упрощение способа и повышение чувствительности определения.

Поставленная цель достигается описываемым способом количественного определения хлордиазепоксида в биологических объектах путем гидролиза непосредственно анализируемой пробы раствором соляной кислоты при 100110 C c последующей экстракцией полученного гидролизата органическим растворителем и хроматографировании полученного экстракта в тонком слое сорбента, элюирования бензофенонов и проведения азосочетания с N-g-нафтилэтилендиамином и дигидрохлоридом и спектрофотометрирования полученного при этом окрашенного раствора.

Отличительным признаком способа является то, что гидролизу подвергается непосредственно анализируемая проба при 100-110 С.

Примеры иллюстрируют предлагаемый способ.

Пример 1. К 25 r гомогенизата каждого отдельного органа (печень, желудок с содержимым, кишечник, почки) в круглодонной колбе с притертои пробкой емкостью 140-200 мп прибавляют „o 100 мл бн раствора соляной кислоты и гидролизуют в течение 2 ч при 100-110 С на глицериновой бане с обратным холодильником.

По окончании гидролиза обратные холодильники промывают 3-5 мл 2н раствора соляной кислоты, присоединяя промывные воды к гидролизату, который фильтруют через ватмановский (бумажный) фильтр (" белая лента) в делительную воронку.

Фильтрат нейтрализуют, добавляя гранулированный едкий натр, и доводят рН раствора до 10 по универсальному индикатору.

2-амико-5-хлорбензофенон, полученный в результате гидролиза, экстрагируют н-гептаном трижды порциями 20, 15, 15. Гептановые извлечения после расслоения фаз переносят в мерную колбу на 50 мл, пропуская через воронку с безводным сульфатом натрия (1-1,5 г). В случае образования эмульсии, с целью расслоения фаз, проводят центрифугирование в течение 5-10 мин. при 5000 об/мин.

Объем раствора в мерной колбе на

50 мл доводят гептаном до метки и тщательно перемешивают .

Хроматографическое определение бензофенона хлордиазепоксида от бено зофенонов других производных 1,4бензодиазпенина и их обнаружение.

По 10, мл полученных гептановых извлечений выпаривают при комнат5

4S

55 ной температуре или на роторном испарителе в выпаривательных колбах до объема 0,5-1 мл, остатки наносят на стартовую линию хроматографической пластинки с тонким слоем силикагеля КСК (0,62 на 1 см, от

250 меш.), закрепленного гипсом (5Ъ от веса силикагеля) в виде 2-х полос (в каждой 10 мп выпаренного экстракта) длиной в 1 см на расстоянии 2 см друг от друга. Рядом на ту же стартовую линию наносят пятно метчика, состоящего из смеси 0,1Ъ этаноловых растворов бензофенонов производных 1,4-бензодиавенина (диазепама, нитразепама, хлордиазепоксида) в количестве 10-15 мкг каждого бензофенона. Хроматографируют в системе бензола. Пробег фронта растворителя 10 см. Время хром=тографирования 20-25 мин. С хроматограммы удаляют органический растворитель под током теплого воздуха (феном)

5 мин.

Часть хроматограммы, соответствующую первой полосе исследуемого раствора, предназначенной для элюирования, закрывают стеклянной пластинкой.

На открытой части хроматограмьы с пятном метчика и 2-ои полосой исследуемого раствора проводят реакцию образования азокрасителя. С этой целью хроматограмму опрыскивают последова.тельно 2н-ым раствором соляной кислоты, 0,1Ъ-ым раствором нитрата натрия, через 5 мин избыток нитрита натрия удаляют обработкой пластинки 0,5Ъ раствором сульфамата аммония и через

1-2 минуты полученную соль диазония сочетают с 0,,1-о-ым раствором N-c(-нафтилэтилендиамина.

B случае присутствия 2-амино-5хлорбензофенона (продукта гидролиза хлордиазепоксида) на хроматограмме через 15 мин образования пятно сиреневого цвета (бензофенон нитрозепама дает пятно разового цвета с R 0,16) сравнивают величину Ry метчика хлордиазепоксида (0,27-0,3) и исследуемого раствора. Реакцией удается обнаружить 1 мкг хлордиазепоксида в пятне.

Из закрытой части пластинки зону селикагеля, соответствующую расположению пятна метчика, собирают на стеклянный фильтр Р 4 и элюируют двумя порциями этанола по 5 мл в мерную пробирку. Элюат доводят этанолом до 10 мл. Снимают спектр 2-, амино-5-хлорбензофенона в УФ области (от 200-400 нм) в кювете с толщиной рабочей поверхности 1 см на СФ-16.

Наличие характерных максимумов поглощения в области 238 нм и 390 нм подтверждает присутствие соединения в исследуемом растворе (Е " /см = 980).

1„

Этаноловый раствор бензофенона после снятия спектра количественно переносят в стеклянный бо.:с, туда

192116 же присоединяют раствор, ocäàâøöéñ÷ в мерной пробирке. Этанол упаривают под током теплого воздуха, а остаток растворяют в 5 мл 2н-ой соляной кислоты при постоянном помешивании в течение 10-15 мин.

B зависимости от концентрации в полученном растворе 2.-амино-5-хлорбензофенона, которую ориентировочно рассчитывают после снятия спектра в

УФ, на реакцию образования азокрасителя берут 0,5,1,0 или 3 мл и доводят (если это необходимо) до 3 мл

2 и-ым раствором соляной кислоты.

Далее последовательно добавляют

0,5 мл 0,1% раствора нитрата натрия, через 5 минут — 0,5 мп 0,5% раствора сульфамата аммония. Азокраситель сиреневого цвета образуется через

15 мин после добавления 1 мл 0,1%-го раствора N-a-нафтилэтилендиамида дигидрохлорида. Окраска устойчива в течение суто ..

Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют на спектрофотометре СФ-16 при 550 нм в кювете с рабочей длиной поверхности 1 см. В качетстве раствора сравнения используют контроль реактивов. Концентрацию хлордиазепоксида в органах определяют по формуле:

1000, С ° V E /сл Vy 2 где Х вЂ” содержание хлордиазепоксида, мг в 25 г органа;

0 — оптическая плотность измеряемого раствора;

V — объем разведенного гидро1 лизата (50 мл);

Н вЂ” количество аликвоты гепта2 нового экстракта, взятого для нанесения на хроматографическую пластинку (10 мл);

40

1;i 0

E /см = где D — оптическая плотность;

С вЂ” концентрация раствора, вес %; толщина поглощающего слоя, см.

Способ позволяет упростить процесс и повысить чувствительность определения с 0,2 мг в 100 г объекта до

0,05 мг в 100 г объекта.

V — количество 2 н-го раствор» соляной кислоты, взятого на растворение сухого остатка;

Ч вЂ” количество аликвоты, взя5 той на реакцию солянокислого раствора;

E / удельный показатель поглощения;

С вЂ” навеска исследуемого opra10 на.

Количество хлордиазепоксида, выделяемого из 25 г органов, представлено в таблице.

Методика: Из стандартного растьо-, ра хлордиазепоксида в этаноле

15 (1000 мкг/мл) готовили серию растворов в мерных колбах на 25 мл, содер-жащих 20,50,100,150,200 мкг/мп. К

0,5 мл этих растворов, помещенных в колбу для гидролиза, добавляют по щ 3,0 мл 2 н-го раствора соляной кислоты и гидролизуют 20-25 минут при 100110ОС на глицериновой бане с обратным холодильником. Охлажденный гидролизат доводят в мерной пробирке до 5 мл. 2 и-ым раствором соляной кислоты и 1 мл из этого раствора берут на реакцию образования азокрасителя (реакция Браттои-Маршалла), описанную выше. После определения плотности окрашенного раствора на спектрофотометре СФ-16 при 550 нм вычисляют удельный коэффициент поглощения по формуле:

792116

Определение количества хлордиазепоксида

0,093 46,5 93,0

0,997 48,5 97,0

0,092 46,0 92,0

0,100 50 0 100,0

0,095 47,5 95,0

1/2

50.

А= 4,77

Х =95,4

1/2

100 — 4,84

2,16 а=95,4+6,87

А= 7,20

g =95,35

1/2 0,388 194,0

0,392 196,0

0,368 184,0

0,373 186,5

0,385 192,5

97,0

200 — 2,54 — 1,13

98,0

92 0

93,25 a=95,35+3,59

A= 3,77

96,5 к =93,95

94, 76

1/5 0,379 473,8

0,365 456,25

0,382 477,5

0,370 462,5

0,383 478,75

500

bх= 1

,"= о

a=93,98

91,35

95,5,88,95+2 18

92,5

95,75 A= 2,32

1/10 0,372 930,0

0,369 922,5

0,378 945,0 Х =93,70 x = 1,69

3„-= О, 75

93,0

92,25

94,5

1000

96,25 a=93,70+2,39

0,375 962,5

0,370 925,0

A= 2,55

92,5

1/10 0(000 х/п

Формула изобретения полученного экстракта в тонком слое сорбента, элюированием бензофенолов и проведением азосочетания элюата с

60 N-а(нафтилэтилендиамином дигидрохлоридом и спектрофотометрированием полученного при этом окрашенного раствора, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения способа

65 и повышения чувствительности опредеО, 189

0,183

0,194

0,180

0,198

Способ количественного определения хлордиазепоксида в биологических объектах с использованием гидролиза раствором соляной кислоты при нагревании с последующей экстракцией полученного гидролизата органическим растворителем и хроматографированием

99,5 99,5

91,5 91,5

97,0 97,0

90,0 90,0

99,0 99,0

Х =95,4 „= 3,21 — 1,43

g =95,4+4,55

792116

10 ения, гидролизу подвергают непосредственно анализируемую пробу при . емпературе 100-110 С. с

Составитель Л. Солом." ; ева

Редактор Т. Морозова ТехредМ.Табакович Корректор О. Билак

Заказ 9431/42 Тираж 1019

ВНИИПИ Государственного по делам изобретений

113035, Москва, Ж-35, Раушская

Подписное комитета СССР и открытий наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Источники информации, )ринятые во внимание при экспертизе

1.. Bernard А, Koechlin and Lucins

)fArconte. nDetermlnation of Chloriiazepoxide and of a Metabolite of

actam Character in Plasma of Humans,.

)ogs ап4 Rats by à specific spectrof iuorometric М!сго Method" Analytical

Biochemistry. 1963, М 5, р.195-207.

2. Сборник "Определение физиологически активных веществ и их метаболитов в биологических объектах" под редакцией А.И. Тенцовой и

М.Д. Швайковой. ..Изотов Б.Н. и др. "Изолирование хлордиазепоксида из внутренних органов трупа", 1977, с. 20-24 (прототип).