Способ определения активностинадн- и надфн-генерирующих дегидрогеназ

Способ определения активностинадн- и надфн-генерирующих дегидрогеназ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е )79407l

Союз Советских

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВМДЕТЕДЬСТВУ (61) Доголнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 30.06.78 (21) 2639621/28-13 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07.01.81. Бюллетень № 1 (45) Дата опубликования описания 22.01.81 (51) М.Кл.з С 12 D 13/10

G 01 N 33/48

Государственный комитет

:СССР (53) УДК 577.15.08 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Автор изобретения

Э. П, Титовец

Белорусский научно-исследовательский институт неврологии, нейрохирургии и физиотерапии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛEHИЯ АКТИВНОСТИ.НАДН- и НАДФН-ГЕНЕРИРУЮЩИХ ДЕГИДРОГЕНАЗ

Изобретение относится к биологии, медиц ине, микробиологии, промышленной биохимии, может быть использовано для определения активности различных НАДН- и

НАДФН-генерирующих дегидрогеназ в специальных биохимических исследованиях, для .контроля технологических процессов (например, в ферментной .и спиртовой промышленности), определения активности дегидрогеназ с диагностической целью в ме- 10 дицине и др.

Известны способы определения дегидрогеназной активности с использован1ием хинонов в качестве акцептора водорода, отнимаемого от субстратов в дегидрогеназной 15 реакции (1).

Наиболее близким по своей технической сущности к предлагаемому является способ, при,котором для определения дегидрогеназной активности в реакционную среду 20 вводят в качестве акцептора водорода и-бензохинон (2). В ходе реакции и-бензохинон восстанавливается до гидрохинона. Через разные, промежутки времени реакцию останавливают добавлением кислоты. Ко- 25 личество оставшегося хинона определяют титрованием и, таким образом, по убыли хинона судят о дегидрогеназной активности. Присутствие кислорода мешает определению хинона при наличии дифенолоксидазной активности в исследуемом материале, поэтому определения выполняют в анаэробных условиях в пробирках Тунберга.

Спектрофотометрический контроль активности по поглощению хинона в видимой области слектра хотя и возможен,.но не дает преимуществ перед способом с титрованнем, так как и-бензохинон слабо поглощает в этой области.

Наиболее существенными недостатками известного способа являются необходимость остановки реакции для .определения активности дегидрогеназ, применение трудоемкого тетриметрического способа определения количества хинона, .использование и-бензохинона в относительно высоких концентрациях 10 - — 10- М, что иногда вызывает ингибирование активности исследуемых дегидрогечаз, а также необходимость полного .исключения кислорода из реакционной среды.

Цель изобретения — расширение диапазона исследуемых объектов и осуществле.ние возможности непрерывного контроля скорости дегидрогеназной реакции.

Поставленная цель достигается тем, что в реакционную смесь дополнительно вводят менадионредуктазу, а в качестве акцептора водорода из ряда хинонов ислользуют анилинопроизводные о-банзохинола.

794071

Это позволяет проводить спектрофотометрический контроль дегидрогеназпсй реакции на максимуме поглощения хинона.

Легко осуществим также полярографический контроль скорости дегидрогена зной реакции по поглощению кислорода, пошедшего на окисление аутоксидабельной дифенольной формы анилинопроизводнь х, .ко. торая возникает в системе при наличии де. гидрогеназной активности. l0

В силу высокой активности анилтп опроизводных о-бензохинона их применяют в концентрации в 10 — 100 раз .ниже, чем а-бензохинон, что исключает побочные эффекты хинонов.

l5

На фиг. 1 приведены кривые определения активности алкогольдегидрогеназы (а), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (б) и изоцитратдегидрогеназы (в); на фиг. 2 график зависимости скорости, потребления кислорода в среде от количества препарата изоцигратдегидрогеназы при измерении ее активности по предлагаемому способу.

Измерения активности изоцитратдегидрогеназы экстракта печени крысы по пред- 25 лагаемому способу в сравнении с другими способами приведены в таблице.

Сущность изобретения поясняется схемой: () (Менадионредуктаза) НЛД (Ф) Н+ Н+о-хинон —:-HA. 2, (Ф)+ +

-i- о-дифенол (2) На приведенной схеме о-хинон пред- 40 ставляет одно из анилинопроизводных о-бензохинона, а о-дифенол — восстановленную форму этого хинона. Реакция (1) проводится в очтимальных условиях для изучаемой дегидрогеназы. Скорость этой 45 реакции лимитирует скорость реакции (2).

Как видно из схемы, реакция (2) выступаег как система, акцептирующая водоро <, появляющийся в основной дегидрогеназной реакции (1),в результате окисления кон 50 кретного субстрата. Физико-химические свойства анилинопроиз водны х о-6 ензо ;HHQна позволяют контролировать активность дегидрогеназной реакции (1) по последовательной реакции (2), включающей анилинопроизводные о-бензохинона.

Способ определения актизности

HAgI (Ф) Н-генерирующих дегидрогеназ осуществляется следующим образом. Готовят среду, содержащую субстрат, НЛД или

НАДФ и другие компоненты, необходимые для проявления активности конкретной дегидрогеназы, в которую добавляют 4-анилино-5-метокси-1,2;бензохинон (АМОБХ) в количестве 100 — ll50 мкмоль или какое-либо %

30 (Дегидрогеназа)

Субстрат восстановленный + НАД (Ф)

+,Субстрат окисленный +НАД(Ф)Н+Н+

35 другое анилинопроизводное о-бензохинона, а также препарат менадионредуктазы, взятой в относительном избытке с тем, тобы ее активность не лимитировала акгивность изучаемой дегидрогеназы. Полную реакционную среду переносят в закрытую кювету спектрофотометра, предназнач».i:íoãî для автоматической записи результатов из,мерений, или в полярографическую ячейку.

В процессе измерений инкубационную смесь принудительно перемешивают. В среду вносят исследуемый* образец,и фиксируют кинетическую кривую активносги дегидрогеназы (записывают изменение оптической плотности на максимуме поглощения анилинопроизводного о-бензохинона

1 или регистрируют кинетическую криву:о поглощения:кислорода в полярографи-.ежих опытах) .

При измерениях по оптической плотности из среды удаляют кислород пропусканием азота или дожидаются естесгвенного истощения кислорода в кювете, что связано с быстрым окислением дифенольной ф ор мы производных.

Активность дегидрогеназ выражают в общепринятых единицах с учетом сгехиометрии реакции.

Пр и м е р 1. Определение активности алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1.) .

Готовят реакционную среду следующего состава: этанол 60 ммоль, НЛД 350 лклоль, АМОБХ 15 лклоль, менадионредуктаза

0,5 мг, фосфатный буфер 0,08 М, рН 7,6.

Среду переносят в полярографическую ячейку и автоматически регистрируют кинетическую кривую поглощения кислорода.

Далее в полярографическую ячейку вводят

180 мкг очищенного препарата фермента, продолжая измерение скорости поглощения кислорода (см. фиг. 1 а).

Пример 2. Определение активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (КФ

1.1.1.48) .

В полярографическую ячейку вносят среду следующего состава: глюкозо-6-фосфат 550 мкмоль, НАДФ 360 мкмоль, ЛМОБХ 150 мкмоль, ЭДТА 3,3 ммоль, менадионредуктаза 0,5 лг, триэтаноламиновый буфер 33 ммоль, рН 7,6 и регистрируют поглощение кислорода .после введения

25 лкг фермента (см. фиг. 1 б).

Пример 3. Определение активности изоцигратдигидрогеназы (КФ 1.1.1.27) .

В полярографическую ячейку внося1 реакционную среду следующего состава: ДЛизоцитрат 6 ммоль, АМОБХ 150 мкло ль, НАДФ 300 мкмоль, менадионредуктаза

0,6 мг, трис-НСI буфер 0,08 М, рН 7,6, поглощение кислорода регистрируют после введения 320 мкг фермента и 1 ммоль

MnSO (см. ф,иг. 1 в).

Внесение дегидрогеназы в полную oeazционную среду приводит к установлению стационарного режима в системе, при кото794071 дается линейная зависимость между количеством фермента,и скоростью изменения окончательного параметра, которым в данном случае является кислород.

Таким образом, использование предлагаемого способа определения активности

НАДН- н НАДФН-генерирующих дегидрогеназ позволяет в течение короткого периода времени получить точные данные об ак)0 тивности дегидрогеназ в ходе самой реакци и.

Таблица

Активность" изоцитратлсгидрогеназы в1лшн на l г препарата, мкмоль.о о

QJ Ю о

I»

Я о

R o

Способ измерения

15! 75,2 1- 11,2

5 20

176,6 4,9

175,2+ 6,7

* Среднее $„—

Как видно из таблицы, определение активности изоцитратдегидрогеназы по предлагаемому способу в сравнении с другими З5 независимыми способами дает совпадающие результаты.

На фиг. 2 приведен график, из которого следует, что при измерении активности дегидрогеназ (на примере изоцитратдегидро- 40 геназы) по предлагаемому способу наблю.ром скорость поглощения .кислорода постоянна и дегидрогеназная активность описывается кинетической кривой нулевого порядка. Цифры на линейных участках графиков соответствуют измеренным активностям дегидрогеназ.

Спектрофотометрическое ! измерение восстанов1 ления 4-амилино-5-меток си-1,2-бе н зо хи н о н а (предлагаемый способ)

Измерение скорости изоцитратдегидрогеназной реакции по образованию НАЛФН (спектрофотометрический контроль при 340 нм) Измерение скорости окисления изоцитрата (контроль активности по изменению рН среды) Формула изобретен ия

Способ определения активности НАДНи HAGI,ФН-генерирующих дегидрогеназ, предусматривающий приготовление реакционной смеси, включающей хиноны в качестве акцептора водорода, инкубацию ее и определение остаточного количества акцептора, о глич ающийся тем, что, с целью расширения диапазона .исследуемых объектов и осуществления непрерывного контроля скорости дегидрогеназной реакции, в реакционную смесь дополнительно вводят менаднонредуктазу, и в;качестве акцептора водорода из ряда хинонов используют анилинопроизводные о-бензохи.нона.

Источники информации, принятые во внимание,при экспертизе:

1. Franke W. Thunberg — Methodik und

Verwandte Acceptor — Methoden. — Handbuch der Physiologich- und Pathologish—

Chemischen Analyse, 2 Bd, 1955, 339 — 340, Springer — Verlag.

2. Bertho А. and Grossman W. Laboratory Methods in Biochemistry. London, 1938, р. 166 — 169 (прототип).

794071

«Х

//; .с„т//,- л

4 ЧР

5 о

4 юд

1 4о г"гп 504

Составитель Н. Паников

Техред И. Пенчко

Корректор И; Осиповская

Редактор Т, Зубкова

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»

Заказ 1751/62 Изд. № 130 Тираж 541 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4/5