Способ энзиматического превращенияглюкозы bo фруктозу

Способ энзиматического превращенияглюкозы bo фруктозу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (1797582 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 12. 03. 76 (21) 2334807/23-04 (51) pA Kga 3 (23) Приоритет — (32) 13, 03. 75

С 07 G 7/02

С 33 К 1/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (33) США (31) 558001

Опубликовано 15.01.81, Бюллетень М 2 (53) УДК 577. 15..07(088.8) Дата опубликования описаиия 17. 01. 81

Иностранцы

Поуль Берге Росениус Поульсен и Лена Элизабет Эиттан (Дания) (72) Авторы . изобретения

Иностранная фирма

"Ново Индустри A/C"

j Дания) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ЭНЗИМАТИЧЕСКОГО ПРЕВРАЩЕНИЯ

ГЛЮКОЗ61 ВО ФРУКТОЗУ

Изобретение относится к способам энэиматического превращения глюкозы во фруктозу и может быть использовано в пищевой и смежных с ней областях.

Энзиматическая иэомеризация глюкозы во фруктоэу основана на использовании энэима глюкозоиэомеразы, который активируется в присутствии

ИОНОВ СО и Мд

Однако это в значительной степени увеличивает стоимости конверсии сиропа, поскольку любое количество ионов кобальта, добавляемое к исходному глюкозному сиропу, должно удаляться из продукта глюкоза-фруктоза с помощью сравнительно дорогостоящих способов ионного обмена. Ионы магния, который является не настолько токсичным, как кобальт, могут в неболь ших количествах содержаться в получаемом продукте. Однако уменьшение использования ионов магния в процессе превращения глюкозы во фруктозу 25 также приводит к удешевлению процесса в связи со снижение 1 затрат на очистку получаемого продукта.

В настоящее время большинство энэиматических способов превращения

@ т а. 1 6

l глюкозы во фруктозу предусматривает проведение процесса в присутствии

СО и Mg+2.

Например, известен способ энзиматического превращения глюкозы во фр;ктоэу путем пропускания раствора, содержащего 5-80 вес.Ъ .глюкозы и ионы СО и Мд в количестве соответственно 10 M и 5 ° 10 М, через колонку с иммобилизованной глюкозоиэомеразой при 20-85 С и рН на входе в -*олонку

6-9. Общее время контакта варьируют в широких пределах, а в качестве иммобилизованной глюкозоизомеразы используют глюкоэоизомеразу Streptoâóces sp. ATCC 21175, иммобилизованную на интертном носителе-анионообменной целлюлозе или анионообменной смоле (размер частиц не указан) (1j ..

Однако получают продукт, содержащий недопустимые примеси используемых ионов Со и Mg 2. Это вызывает необходимость дополнительно очищать целер и продукт ионообменными способами с использованием дополнительного оборудования и затрат. Кроме того, используемая в способе иммобилизованная глюкозоиэомераэа разрушается под воздействием температуры, при

73 /582!

О которой проводится процесс изомериз ации.

Осуществление процесса при рН, близком:к 9 (при большом времени контакта), вызывает нежелательное окрашивание получаемого продукта, что также является недостатком известного

1 пособа.

Цель изобретения — упрощение процесса и улучшение качества целевого продукта.

Укаэанная цель достигается тем, что в способе энзиматического превращения глюкозы во фруктозу используют сироп, содержащий ионы Hg в количестве 10 -10 М, причем содержание Ид+ взаимосвязано с концентрацией ионов

Са, которые дополнительно содержатся в исходном растворе в количестве

10 — 10 И, путем следующей зависимости: молярное соотношение концентраций Hg /Са+ составляет 5-500 при концентрации ионов Mg, большей 1(ГЪ, и 5-10 при концентрации ионов Mg меньшей или равной 1(Г М, в качестве иммобилизованной глюкозоизомеразы используют иммобилизованную с помощью 25 глутарового альдегида глюкозоизомераэу Вас coagulans с размером частиц

0,01-1 см, и процесс ведут непрерывно, Предпочтительно концентрация ионов gg

Mg составляет 10 -5х10 М, а ко *Ф центрация ионов Са составляет 10

2,5 х 10 M и при соотношении концентраций Mg /Са (5-10):1.

Обычно в процессе используют раст- у вор глюкозы с концентрацией 4045 вес.Ъ, время контакта исходного раствора с иммобилизованной глюкоэоизомеразой составляет 10 мин — 2 ч, а процесс предпочтительно ведут при

60-70 С. 40

Таким образом, предпочтительное осуществление способа включает обработку с помощью такого небольшого количества добавляемог магния, что последующий изомеризационный ионный об- 45 мен можно устранить.

В процессе используют иммобилизованную глюкоэоизомеразу, полученную иэ клеток Вас, coagulans, которая отличается стабильностью и высокоактив- ур ностью. Конкретно, в качестве препарата иммобилизованной глюкоэоизомеразы используют клетки микроорганизмов

Вас. coagulaks, поперечно сшитые с глутаровым альдегидом, которые подвер= гают значительной деструкции. Предпочтительно препарат энзима получают из клеток, которые подвергались гомогеииэации до начала реакции с глутаральдегидом.

Способ получения ферментативно ак- 59 тивной, физически стабильной, водонерастворимой глюкозоизомеразы из клеток микроорганизмов Вас. coagulans включает концентрирование и гомогенизацию клеток микроорганизмов с получением гомогенизированного концентрата клеток, содержащего разрушенные клетки, и с сухим содержанием вещест-. ва 3-30 вес.Ъ, взаимодействие указанных клеток концентрата с 0,011,0 вес.ч. глутаральдегида на часть сухого вещества для создания таким образом связанного твердого продукта и удаление после этого воды и измельчение этого связанного продукта.

Способ получения глюкозоиэомеразы, включает культивирование в аэробных условиях атипичных Вас. coagulans, продуцирующих r.÷þêîçîèçîìåðàçó, причем указанные Вас. coagulans способны расти лишь на неорганических источниках азота в качестве источников азота при 65 С на питальной среде, соо держащей источник азота, источник углерода, при возможном включении кснлозы, небольшие количества неорганических солей, при рН 5-9 и температуре 40-65" С, после чего выделяют полученную таким образом глюкоэоиэомеразу.

Биохимические потребности иммобилиэованных энзимов изомеразы глюкозы из Вас. coagu}ans a KO6aJIE Те могут полностью удовлетворяться без добавки кобальта в процессе изомеризации.

В результате исключения Со из глюкозного сиропа производительность процесса изомеризации и стабильность энзима не ухудшаются, а в некоторых случаях улучшаются.

Биохимические потребности энзима глюкозоизомеразы в магнии намного меньше, чем полагали ранее. Фактически добавление Hg можно вообще устра+2. нить, если концентрация Са является низкой. Потребности активации изомеразы глюкозы ионами Hg+ полностью удовлетворяются при рН 7,8 или более при использовании менее 10 + N Hg .

Ионы кальция в сиропе являются ингибиторами, .вероятно, в большей степени, чем было установлено .до сих пор. Очевидно роль ионов Hg в сиропе сводится большей частью к тому, чтобы препятствовать ингибированию Са . Низкое содержание кальция в сиропе позволяет снизить содержание . о магния. Отношение Mg /Са в сиропе должно превышать 5:1 в мольном соотношении, преимущественно это отношение должно превышать 10:1, но не

500:1, если концентрация ионов Hg ( (10 М.

Протекание реакции энзиматической,. иэомеризации глюкозы при рН более

8,0 вызывает окрашивание продукта.

Этого избегают при обычной иэомеризации, проводимой при рН ниже 8,0, с целью уменьшения цветообразования.

Удаление окраски полученного сиропа, например, путем обработки активированным углем входит в с-оимость o6 работки. Однако степень окрашивания.

797582 глюкозного сиропа увеличивается с увеличением рН.

Исследование тенденции к окрашиванию показывает, что скорость окрашивания при всех уровнях рН является функцией времени. Короче говоря, бо.лее высокая скорость скрашивания при рН 8,0 может нивелироьаться более быстрой изомеризацией. В результате ограничения общей выдержки или времени контактирования глюкозного сиропа в реакторе энзимной конверсии до ® менее 3,5 ч получают сироп подходящего цвета.

Если продолжительность контактирования ограничивается менее, чем

1 ч, то обработку с целью поглощения окраски получаемого сиропа можно не. проводить. Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими особенностями: для иэомеризации не добавляют Co+, для изомериэации нет необходимости добавлять Mg a больО ших количествах, не требуется проведения ионного обмена после изомеризации с целью удаления вредных ионов, энзим обладает отличной теплостойкостью, производительность способа улучшается, способ пригоден для непрерывной работы колонны, падение давления на единицу длины колонны является небольшим, уровень конверсии составляет 40-45%. ЗО

Итак, способ заключается в проведении изомеризации глюкозного сиропа в виде непрерывного процесса при рН подаваемого сиропа в интервале

7,8-8,6 с продолжительностью контак- 35 тирования менее 3,5 ч, предпочтительно, менее 2 ч. При непрерывном процессе 30-55Ъ (вес/вес/ глюкозного сиропа превращается в сироп, содер-. жащий желаемый уровень фруктозы, по 40 крайней мере 40о, обычно около 45%.

Температура конверсии составляет

60-85ОС, предпочтительно 60-7(FC.

Интервал рН 7,8-8,6 поступающего сиропа поддерживается .путем регулирования щелочью (NaOH или Na C03) и, если 45 необходимо, путем повторного регулирования в избранных точках в реакторе конверсии. рН изомериэованного выходящего сиропа является более низким, чем рН входящего сиропа. Обычно раз- 50 ница между рН входящего сиропа и рН выходящего сиропа составляет от 0,2 до 0,6. Регулирование рН важно при осуществлении предложенного способа.

Если рН слишком высокий, например 55 выше л-8,6, то происходит нежелаемое окрашивание (если продолжительность контактирования большая). Если рН является слишком низким, например ниже 7,6, то добавление Co+ необходимо для поддержания активности энзима.

Оптимальная величина рН для энзима из Вас. coagutans составляет 8,5.

Промышленный периодический процесс обычно осуществляется при прсполжнтельном времени контактирования вследствие использования сравнительно небольших концентраций энзима. По этой причине рН следует поддерживать ннзКим Во избежание окрашивания и активность энзима при этом рН будет значительно меньше, чем при оптимальном рН.

Необходимо добавление Со . При .непрерывном способе продолжительность контактирования может поддерживаться небольшой и рН может быть высоким.

Иэомеризацию можно осуществлять при очень близком к оптимальному значению рН энзима. Со "можно н добавлять.

Таким образом, непрерывный способ обладает преимуществами по сравнению с периодическим процессом.

Количество Hg, добавляемое к подаваемому сиропу, составляет менее

-.10 М, предпочтительно менее 5х10 " И.

Однако, допуская низкие уровни Hg+, следует контролировать содержание кальция в поступающем сиропе до менее

1 -4

0 M„ что, например, можно сделать при образовании сиропа из воды с малым содержанием кальция или путем соответствующей обработки глюкозного сиропа с целью ограничения кальция до менее 2,5 х 10 И. Во всяком случае, Если присутствует кальций, то к сиропу добавляют достаточное количество магния для создания избытка ионов Hg по отношению к содержанию кальция в нем до молярного отношения

Mg /Ca более 5:, предпочтительно более молярного отношения Мд /Са

10:1.

+Е -Я

Содержание Hg и Са контролируется и регулируется таким образом, чтобы в результате удаления Са -с помощью ионного обмена из глюкозного сиропа, если необходимо, избежать получения концентрации ионов.Са+ в количестве, большем 10 М, а ионов Mg" — в количестве, большем 10 . Если в глюкоз ном сиропе содержится более низкая концентрация Са+, то добавляемое количество Hg может умейьшаться в со+2 ответствующем отношении, таком, что

Мд Са подперживается в интервале

5-500 для Мд+, большем 10, и является более высоким, чем 5 для Hg

ЙО Ъ1 (см. чертеж) . Та.<им образом, предпочтительно в сиропе содержится менее 25 х 10 M Ca и 5 х 10 M Mg.

Практически глюкозные сиропы, которых касается изобретение, получают из гидролизата крахмала. Часто получение сиропа начинается путем суспендирования крахмала в жесткой воде проводной воде, и поэтому там находится Са .

Ч..то гидролиз крахмала и осаха ривание гидролиэата крахмала проп водятся энзиматически, используя Саактивированные.энзимы. Поэтому Саа редко отсутствует в глюкозных сиропах (помимо тех, которые получают в ла797582 бораторных условиях непосредственно из кристаллической декстроэы с помощью деионизированной воды), нужно следить за тем, чтобЫ содержание Са

-Ь е превышало 10 M.

При непрерывных процессах изомеризации практический размер частиц энэима определяется условиями обработки сиропа (и оборудования). Для .способа с использованием колонны, который является предпочтительным для изобретения, частицы более .100 р являются предпочтительными (поскольку колонна склонна к засорению, если используются маленькие частицы/. B процессах с использованием тонкого слоя (например,. иэомеризация в реак- 15 торе с фильтр-прессом) можно использовать частицы любого размера.

В нижеследующих примерах конкретного осуществления изобретения активность иммобилизованного энзима измеря gg ется в единицах IGIC (международная единица). 1 IGIC определяется количеством энзима, который катализирует изомеризацию глюкозы во фруктозу с, на чальной скоростью 1 м/моль/мин при обычных условиях, т.е. при 40 вес.Ъ глюкозы, рН 8,5 на входе, 65 C u

О

4 х 10 5 М Иц без Са, в колонне с непрерывным уплотненным слоем, размер колонны 2,5 х 40 см..

В примерах производительность энзима за указанное время (ч) определяется в виде количества глюкозы в кг, которую мбжно превратить в смесь фруктозы и глюкозы со степенью конверсии 0 45 на кг энэима с начальной 35 активностью 100 IGIС/г. . Используете препараты энзима обладают активностью от 150 до 250

IGlC/г. Для сравнения результатов из препаратов с различной активностью 4р все величины производительности пересчитывают на энзим с активностью

100 IGIC/г.

В примерах продолжительность контактирования соответствует получению 45 энзима с активностью 100 IGIC/г. Например, продолжительность контактирования 1 ч с получением энзима активностью 200 IGIC/ã соответствует продолжительности контактирования 2 ч с обычным получением активности

100 IGIC/г.

Пример 1. Изомеризацня в приФ"Х сутствии и отсутствии Со

Все иэомеризации проводят в виде непрерывных реакций в потоке с исполь-55 зованием заглушек в виде уплотненной насадки.

Энэим Вас coagulans получают следующим образом.

1. Приготовление концентрата и его ® иммобилиэация.

Культивируют клетки Bac. coagulans штамма NRRL В 5656, затем клетки выделяют из ферментационного бульона путем центрифугирования с самоочищающейся камерой при рН, близком к 6,3, Концентрат содержит -приблизительно

10Ъ сухого вещества и около 40Ъ интактных клеток.

К 1 кг концентрата добавляют 38 мл коммерческого 50Ъ-ного глутаральдегида при интенсивном перемешивании для тщательного смешения глутаральдегида с клеточным концентратом. После этого реакционную массу оставляют в покое при температуре окружающей среды.

Спустя 1 ч реакционная смесь загустевает в однородную массу консистенции творога. Эту массу разбивают слабым перем шиванием и промывают двумя объемами деионизированной воды, после чего воду сливают.

Эатем частицы геля переносят в вакуумную барабанную сушку, в которой приблизительно 1 кг продукта дегидратируют до веса около 160 r. В процессе дегидратирования мягкие гелеобразные кусочки превращаются,в жесткие кусочки материала постоянных размеров. Дегидчатированные образцы измельчают далее до частиц с размером менее 1 мм в диаметре. Регенерация энзима от загрузки к загрузке будет изменяться от 50 до 60Ъ его первонаальной активности. Однако около

15 вес.Ъ конечного продукта составляют чре",вычайно мелкие частицы материала (1-70 yn).

2. Иммобилиэация замораживанием.

Повторяют процедуру примера 1 до получения смеси концентрата клеток и глутаральдегида и получения гелеобразной массы неактивного препарата.

После этого гель 1,в контейнере) помещают в глубокий холод и оставляют там в течение ночи. На следующий день замороженный гель оттаивают до температуры окружающей среды, при этом он превращается в водную массу. При перемешивании добавляют еще воды, после чего ее сливают. Эатем полученный продукт сушат в роторной сушилке до веса около 160 r.

Конечный продукт состоит иэ пористых частиц, по внешнему виду несколько напоминающих хлопья. Восстановление первоначальной активности от загрузки к загрузке составляет

60-70Ъ. фактически отсутствуют мелкие частицы. Размер частиц изменяется от 150 до 2800ILI. Препарат энзима предварительно вымачивают в 40 вес.Ъ глюкозного сиропа при комнатной температуре в течение 1 ч. Эту предварительно вымоченную изомеразу глюкозы загружают в различные колонки с водяной рубашкой. Поток глюкозного сиропа, обладающий определенной концентрацией, рН и другими характеристиками, приведенными в табл. 1, пропускают вверх через материал энэима.

Скорость потока регулируют с целью получения степени конверсии выходя797582

10 щего сиропа 45%. Линейная скорость всегда превышает 10 см/ч (ограничение пленочной диффузии) . Концентра,ция Са в этом. примере составляет .менее 2,5 х 10 5 М.

Продолжение табл. ъ Г 4 5 6

Та блица 1

Sx10

1 60 40

2 60 40

3 65 40

8,5

8,5х10 Sx10

0 8х10

8,5

8,5

4 65 40

3,5х10 8х10

8,5

Таблица 2

Колон- Рабочие характеристики Показатели по опытам ка 1 2 3 4

5 6

Производительность на

100 IGIC/г

340 315 420 375 395 410

65 60 52 42 28

Продолжительность контакта на 100 IGIC/г, мин

Производительность на

100 IGIC/ã

90-140 90-150 75-145 75-180 75-270 75-185

69 59 44 46

90-130 90-155 75-125 75-170 75-170 75-170

350 320 440 370 400 415

60 45

Продолжительность контакта на 100 IGIC/г, мин

В табл. 2 (и в подобных таблицах, которые представлены ниже), где указано несколько значений для продолжительности контакта, первая величина соответствует началу опыта с высокой активностью, а последняя — окончанию опыта с более низкой активностью.

Из табл. 2 можно сделать следующие выводы: производительность на

100 IGIC/г и остаточная активность являются лучшими без Со, чем с добавлением Со+, если рН поддерживают на рекомендуемом уровне, если рН

1 будет ниже рекомендуемого уровня, то производительность на 100 IGIC/г и остаточная активность будут лучше с исполЬзованием Со, чем без него, но величины с использованием Со будут меньше, чем величины, полученные

Остаточная активность, 60 мл

Остаточная активность, 1 л %

5 65 40 7,6 0 8х10 б 65 40 7 б 3 5х10 8х10

Используют колонки различного размера, т.е. колонки размером 1,5 х х 35 см и 5,8 х 45 см, при этом первый размер кавается диаметра, а второй высоты колонны. Для краткости колонны далее обозначают в виде 60 мл и 1 л колонн соответственно. 9 г энзима за-!

3 гружают в 60 мл колонке и 225 г энзима — в 1 л колонке.

Все изомеризации продолжаются в течение 450 ч. Затем измеряют остаточную активность и производитель20 ность на 100 IGIC/r и подсчитывают продолжительность контакта на 100

IGlC/г. Результаты показаны в табл.2. беэ Со, и при рН в пределах рекомендуемого уровня.

Пример 2. Изомеризация в присутствии и отсутствии .Mg . 0 Иэомериэации проводят, как указано в примере 1 °

Следующие. параметры поддерживают постоянными во время экспериментовг

Концентрация глюкозы,вес.% 40 рН на входе 8,5

Добавление Со

Vl

Нет

-5

Концентрация Са, М Менее 2 5х10

Температура,оС 65

Добавление магния изменяется от

0 до Р х 10 M. еО После 450 ч изомеризации эксперименты прерывают. Определяют остаточную активность и производительность на 100 IGIC/г и подсчитывают продолжительность контакта .на 100 IGIС/г.

65 Результаты указаны в табл. 3.

79! )82

Та блица 3

Колон- Рабочие характеристики П ка 0

Производительность на

100 IGIC/r

400 419 424 415 420

60 мл Остаточная. активность, ф

50

50

Продолжительность контакта на 100 IGIC/ã, мин 75-150 150 150 145

Производительность на

100 IGIC/ã

410 435 435 450 440

Остаточная активность, 1 л %

58 60 62

60

Продолжительность контакта на 100 IGIC/г, мин

75-130 75-125 75-125 72-125 78-125

Из табл. 3

Mg не влияет

+2 на 100 I G I C/ã ность °

Конце нтрация глюкоз ы, вес . % 4 0 рН на входе 8,4

Температура,оС 65.

Переменный Мg+, М 4х10

Переменный Са>, М Менее 2 5х10

Активность в контрольной колонне (без Са ) измеряют с использованием параметров, показанных в скобках.

После работы в течение 800 ч энзим в контрольной колонке теряет активность до 253 от своей начальной активности. Цифры в табл. 4 представляют собой Ъ активности по отношению к энзимной активности контрольной колонны после работы в течение такого же количества часов. видно, что добавление на производительность или остаточную активПример 3. Изомеризация с.изменяющимися отношениями Mg и Са

+Я.

Изомеризации проводят согласно описанному в примере 1.

Одновременно используют 5 колонн 35 по 60.мл, одну — с постоянным добавлением Mg к поступающему сиропу и без добавления Са, а другие — с из Ж. +Q. меняющимися отношениями М9 и Са в глюкозном сиропе. 4О

Используют следующие параметры:

Таблица 4

Часы Му/ca =- 1, 4 Часы Hg Co 2, 8 Часы Мф/Сп= 4, 2 Часы Му/6т= 8, 4

1 100

20 94

1 100

20 96

1 100 1 100.

45 56 40 96

60 94

70 60

100 52 90 96

120 52

120 79

134 80

1щ =-"300 ч

ЬХ/2 ==100 ч

4 у = .= 800 ч

Пример 4. Зависимость изомеризации от концентрации глюкозы в поступаюшем 0иропе.

Изомеризацию проводят, как описа65 но в примере .3.

Результаты по табл. 4 показывают, что отношением Mg /Са является важным для срока службы энзима, отношение должно превышать 5, преимущественно 10.

20 99

60 96

120 89

180 84

240 81

20 100

100 100

200 89

240 92

300 83

420 78

g I 71000 ч

797582

Пример 5. Влияние рН на активность °

Влияние рН на активность получаемой иммобилиэованной изомеразы глЮкозы, полученной, как описано в примере 1, определяют в колонне с непрерывным потоком с заглушкой размером 2,5 х 35 см. Изомеризацию проводят, как описано в примере 1.

Перед измерением активности колонну выдерживают в течение 5 ч для достижения равновесия. Затем величина рн загрузки изменяется до следующей величины, после чего колонна работает еще 5 ч. и т.д. При этом используют следующие параметра:

Концентрация глюкозы,вес.Ъ 40 рН Изменяется от 5,0 до 9,5

Температура,оС 65

Со Нет О м, м 0,004э

Менее 2,5 х 10

Продолжительность контакта, мин 50

В табл. б показан относительный Ъ активности, максимальная активность при рн 8,5 принимается за 100

Таблица 5

Производительность на 100 IG1C/ã

430 410 380

48 50 50

75-15085-17095-190

Остаточная активность,%

Продолжнительность контакта, мин/100

I G l С. Таблица б

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 рН

Активность, Ъ 5 15 45 60 70

85 95 100 95 90

Пример 6. Зависимость активности и стабильности от температуры.

Изомериэации проводят, как описано в примере 1, с использованием иэомераэы глюкозы,. полученной, как описано в примере 1. 7 колонн работают в изотермическом режиме при раэлич- QQ ных температурах в интервале 60-90 С.

Измеряют начальную активность, а также полупериод (как время, необходимОе для уменьшения активности на 50% от начальной активности).

Используют следующие параметры:

Концентрация глюкозы,вес.% 40 рН 8,5

Температура Переменная

Со Нет

0,00ь4

Менее 2,5 х 10

Получают следующие результаты, приведенные в табл. 7.

Т а б л и ц а 7

Продолжение табл. 7

40- 80

30- 60

25- 50

23- 45

125

75 55

80 70

85 90 10

90 100 2

d0

90-180

75-150

56-110 в5

600

30 450

40 250

70

Используют следующие параметры:

Концентрация глюкозы,вес.Ъ 40-50 рп на входе 8,4

Температура,сС 65

Со+ Нет

И9+, М 0,004

Са, М Менее 2,5х10.

В табл. 5 производительность, остаточная активность и продолжительность контакта указаны для работы в течение 450 ч в 60 мл колоннах.

fI р и м е р 7. Влияние размера частиц на активность.

За исключением получения знэима изомеризации проводят, как описано в примере 1. B этом примере используют два препарата энэима, обозначенные Х и У соответственно. Перед тем, как препараты энэима загружают в колонны, их классифицируют.

При этом .используют следующие параметры:

Концентрация глюкозы,вес.Ъ 40 рН 8,0

Температура,оC 65

Со+

Нет

МК-, м 0,004

Са, М Менее 2,5х10

Полу:ение препарата Х (см. в примере 1 .

797582

15

Приготовление препарата У.

Иммобилизация флоккулянтом.

А»1550 л культурального бульона от

° ферментации Вас. coagulans NRRLB 5656 концентрируют путем центрифугирования при 10оС, в результате чего получают взвесь, содержащую около 12 r сухого веса, 100 мл концентрата.

11 кг этого концентрата (рн 7,9) оставляют при 20ОС на 3 ч при осторожном перемешивании для того, чтобы осуществить автолиз. рН поддерживают 1О на уровне 6,5 с помощью разбавленной уксусной кислоты. К взвеси, содержа"

В= в растворимой форме добавляют 330 мл

50%-ного глутаральдегидового раство- 3 5 ра, в результате чего получают концентрацию глутаральдегида в реакционной смеси около 1,4% {вес/объем .

Спустя 1 ч частично сшитый гель интенсивно перемешивают после добав- 2О ления 20 л деиониэированной воды. К ,этой суспензии добавляют 80 мл 30%-! ного раствора Drewf1ос ЕС 25 для получения прозрачного раствора. Затем суспензию отфильтровывают для того, чтобы удалить по мере возможности во» ду. Фильтровальную лепешку высушивают в вакууме .при 35 С. Высушенную леО пешку измельчают до частиц размером менее 30 мк. Активность определяют по изомеризации в загрузке с высушенным распылением порошком, получен ным из концентрата в качестве сравнения. Условия следующие: рН = 7,0, 65 С, 0,1 r Co50 7 Н рО/1 2,0

Hg 50 ° 7Н О/1, 40% глюкозы (вес/объем) М

Питательную среду продувают азотом.

Кажущаяся активность иммобилизованного фермента составляет более 70% по сравнению с контролем. После использования иммобилизованный фермент уда- 4Q ляют фильтрованием и повторно используют. Это повторяют 5 раз. После пятикратного повторного использования активность остается на прежнем уровне.

Вторую часть автолизированных клеток концентрата обрабатывают 20 мл

30%-ного Drewfloc ЕС 25 на 1 кг взвеси перед взаимодействием с 1,4%-ным глутаральдегидом (вес/объем/. В результате получают практически тот же самый продукт.

Влияние размера частиц на активность препаратов Х и У видно из табл. 8 и 9.

Таблица 8 продолжение табл. 8

1000-1410

1410-2000

2000-2800

Таблица 9

75-250

250-354

354-500

500-707

707-1000

100

39

1

Установлено, что стабильность не зависит в значительной степени от размера частиц. Yàê видно из вышеуказанных значений, активность некоторых препаратов больше зависит от размера частиц, чем от других параметров.

Пример 8. Получение окраски.

Изомеризации проводят таким же образом, как в примере 1, б колонн наполняют различным количеством энзима, поддерживая степень конверсии и продолжительность контакта постоянными и равными 45% и 1 ч соответственно.

При этом используют следующие параметры:

Концентрация глюкозы, вес.% 45 рН 8,5

Температура Переменная

Со Нет

8 х10" 5

С а+, M Менее 2 5 х 10

Наблюдается увеличение показателя цвета по Icumsa, как показано в табл. 10, после л100 ч изомериэации.

Таблица 10

Температура, o C Показатель цвета по lcumsa

60 24

65 25

70 36

75 30

80 39

85 65

П р и м е ч а н и е: Цвет по icunsa = 10 где О. — ОД4, (оптическая плотность);

Ь вЂ” 05 в г/мл (сухое вещества);

65 с — измеренная длина клеток, см.

297-500

500-1000

17

797582

Энзим, z

470 23000

Изотермическая температура, оС 65

Концентрация глюкозы, Ъ

40 40

8,5

8,5 рН на входе 8,5

+2.

Мд, М

0,0008 0,0008 8 х 10

Со

Нет

Нет Нет

Менее Менее Менее >

2,5х10 2,5х10 2,5х10

Са, M

Продолжительность общей изомеризации, ч

450 450

450

Производи- тельность

100 IGIC/г 440

420

Остаточная активность, ф

50

Продолжительность контакта на 100 IGIC/ã, мин

75-150 75-150 75-140

Пример 9. Влияние размера колонны (по мере увеличения ее размера) .

За исключение получения.энзима изомериэацию осуществляли так, как описано в примере 1.

Энзим получают, согласно методике приготовления препарата У, описанной в примере 7. Размер частиц составляет 150-500Р

Используемые параметры указаны в табл. 11.

Таблица 11

Таким образом, при увеличении размера колонны, начиная от 60 мл, способ иэомеризации можно осуществлять без каких-либо трудностей и при одинаковых показателях производительности и остаточной активности.

Формула изобретения

1. Способ энзнматического превращения глюкозы во фруктозу путем пропускания раствора, содержащего глюкозу в количестве 30-55 вес. 4 и ионы

° (.

Ид, через колонку, co,;åðæàùóþ частицы иммобилизованной глюкозоизомераэы, при общем времени контакта от 0 мин до 3,5 ч, температуре 60-85ОC, рН раствора на входе в колонку 7,8-

8 6, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества целевого поодукта, содержание ионов Мд+ в растворе составляет 10 -10 N, а раствор допол-э Q. нительно содержит ионы Са в количест+ ве 10 -10 N, причем молярное соД отношение концентраций Ид /Ca составляет 5-500 при концентрации ионов

Идл, большей 10 М, н 5-10 при кон-ь центрации, меньшей или равной 10 И, а в качестве иммобилиэованной глюкоgg эоизомераэы используют иммобилизованную с помощью глутарового альдегида глюкозоиэомераэу Вас. coagutans c размером частиц 0,01-1 см, и процесс ведут непрерывно.

35 2. Способ по и. 1, о т л и ч а— ю шийся тем, что концентрация ионов Mg составляет 10 е -5x10 М, а концентрация ионов Са составляет

10 8 -2,5x10 6 и при соотношении концентраций Mgц /Cs+ (5-10): 1.

4О 3. Способ по и, 1, о т л .и ч а ю шийся тем, что время контакта исходного раствора с иммобилиэованной глюкоэоизомераэой составляет 10 мин

2 ч.

45 4. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что исходный раствор содержит глюкозу, в количес- зе 4045 вес.Ъ.

5. Способ по и. 1, о т л и ч а ю50 шийся тем, что процесс осуществляют при 60-70 C.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент CtIIA 9 3788945, кл. у кл. С 07 G 7/02, опублик. 29.01.74 (прототип).

797582

Рф9"= 10

pf )О 4

9 =

"-2" /О ГаСа" д

Заказ 9823/82 Тираж 408 Поднисное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

35 Москва Ж-35 Ра ская наб. . 4 5

Филиал ППП "Патент", r Ужгород, ул. Проектная,: 4

Составитель O. Скородумова

Ре актор |,". Лыжова Техред И.Асталош Корректор Н. Шв кая