Способ определения субстрата или фер-ментативной активности b биологическомматериале

Патент 797592

Авторы

Классы МПК

C12Q1/26 - использующие оксидоредуктазу

Способ определения субстрата или фер-ментативной активности b биологическомматериале

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Всесо»оз» «» я и иС ЁЖ-и4 .

Союз Советских

Социалистических

Республик

{»»»797592

К ПАТЕИТУ (6») Дополнительный к патенту (51)М. Кл.з

С 12 Я 1/26 (22) Заявлено 06.05. 77 (2») 2481956/28-13 (23) Приоритет - (32) 09 ° 06 ° 76 (31) .Р 26 25 834 . 4 (33) ФРГ

Государственный комитет

СССР по делам изобретеннй н открытий

Опубликовано 15.0181.Бюллетень М 2 (53) УДК 6 12. 015 . 1 (088.8) Дата опубликования описания 1701,81

Иностранцы

Иозеф Даннингер, Ульферт-Денеке, Гунтер Ланг, Герхард М хал и Петер Решлау (И Г) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Берингер Маннхайм ГМБХ" (71) Заявитель (ФРГ) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБСТРАТА ИЛИ ФЕРМЕНТАТИВНОИ

АКТИВНОСТИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения субстрата или ферментативной активности.

Известен способ определения субстрата или ферментативной активности в биологическом материале путем проведения окислительно-восстановительной реакции |1) .

Однако известный способ не позволяет провести точные определения, поскольку в биологическом материале имеются другие восстановительные вещества, которые создают помехи. Наиболее часто встречается аскорбиновая кислота, которая нарушает течение окислительно-восстановительных реакций с использованием НоОо образуюшего фермента, тетразолия или фенола.

Цель изобретения вЂ” повышение точности способа определения.

Поставленная цель достигается тем, что в реакционную смесь вносят аскор-25 батоксидаэу в Количестве 100 Ео/мл исходной смеси, а учет реакции ведут по образованию окрашенного продукта.

Кроме того, для получения окрашенного продукта аскорбатоксидаэу вводят одновременно или с НоОо. образуюшим ферментом, или с солью тетраэолия или же с феьолом.

Используемую аскорбатоксидазу можно получить иэ Zucchini (Cucurbuta реро »»»edullosa).

Предпочитаемыми методами для предлагаемого способа являются определение глюкозы с пероксидаэой или глюкозаоксидаэой и о-дианизидином или

2,2-азино-ди-3 -этилбензтиазс инсульфонатом (ABTS), определение глюкозы по методу гексокинаэы глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы), обнаружение мочевой кислоты посредством фенола, аминоантипирина, пероксидаэы и уриказы, определение тироэина или пирокатехина посредством SMBTH (4-метил-б-калийсульфонил-бензтиазолонгидразона(2)) и тирозиназы или дифенолокси дазы.

Пример 1. Определение глюкозы с о.-дианизидином, пероксидазой, (POD) и глюкоэаоксидазой (GOD), изм ренное в фотометре, с длиной волны

432 нм, с температурой измерения

25оС (см. табл.1).

Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению (нет аскорбиновой кислоты). Кюветы 2 и 3 показывают, 797592

Таблица 1

2,5 2,5

0,1 0,1

0,05 0,05

2,5

2,5 о-Дианизидин,, 0,5%

0,1

0,05

0 05

0,05

POD, О, 18% что 0,00573 или 0,000573% аскорбата практически полностью тормозят тест до 41,5%,кюветы 4 и 5-пок зывают полное устранение нарушения этих концентраций аскорбата добавкой по

0,0003% аскорбатоксидазы.

Пример 2..Обнаружение глюкозы с 2,2,-азино-ди(З-этил-бензтиазолинсульфонатом(6) ) (ASTS), РОЗ и ЯОЭ в фотометре, с длиной волны 432 ни, с температурой измерения 250С (см. табл. 2 .

Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению (нет аскорбата). Кюветы 2 и 3 показывают, что 0,000573% или 0,0000573 мол.% аскорбата полностью тормозят тест до 2,1%.

Кюветы 4 и 5 показывают полное устранение нарушения этих концентраций аскорбата добавкой ro 0,ОООЗЪ аскорбатоксидазы.

Пример 3. Обнаружение моче- 26 вой кислоты посредством фенола, аминоантипирина, РО0 и урикаэы на аналитическом автомате (Aute Ana1уzar).

Принцип теста; Мочевая кислота +

+ O + H

+ Н О 2 Н Од + 2,4-дихлорфенал +

+ 4-аминоантипирин вЂ” хинодный краситель + 2 Н О

Изготовление растворов.

Реактив аскорбатоксмддэы. 9 600 мп З© бидистиллированиой воды растворяется содержимое флакона 1. Добавка О,З мл

Вг Ц-35. Затем смесь выдерживается в темном флаконе приблизительно щж

40С четыре недели,при 25оС одну не-9 делю.

Реактив уриказы. В 800 ил биднс тиллированной воды растворяется содержимое флакона 2. Добавка 2,0 мп

8rij-35. Затем смесь выдерживается в темном флаконе приблизительно нри 49

4 оС четыре недели, приблизительно при 25ОС одну неделю.

Концентрация растворов.

0,63% фосфатного буферного раствора, рН 5,6. g$

О, 35% трис/лимонной кислоты, рН 8,9, уриказы ) 0,001%, Р00 yi 0,000015%, 0,05% 2,4-дихлорфенола, 0,08% 4-аминоантйпирина.

Пример 4 ° Обнаружение глюкозы с НК/Я 6Р-ОА, МАРР, (NT и диа-, l

Фосфатный буферный раствор, рН 7,01, 1,368% форазой в фортометре. Измеряемая длина волны 492 нм, температура инкубацин 25оС (см. табл. 3) .

Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению. Кювета 2 показывает, что 0 0000573% аскорбата может тормозить тест на 34% кювета 3 пока1 зывает, что 0,0003% аскорбатоксидазы полностью устраняет это нарушение.

П р и и е р 5. Определение глутамата посредствои диафоразы в фотоиетре. Измеряемля длина волны 492 нм, температура 25оС(см. табл. 4).

Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению.

Кюветы 2 и 3 показывают, что

0,0029Ъ нли 0,00029Ъ аскорбата тормозят тест на 7003 или на 100%.

Кюветы 4 и 5 показывают полное устранение этого нарушения добавкой

0,00006Ъ аскорбатоксидазы.

П р и и е р 6. Определение тнрозина с 3-метил-6-калийсульфонил-бензтиазолон-гидраэоном-(2)(SNBTH) и тнрозиназой в фотометре, измеряемая длина волны 492 ни, измеряемая температура 25оС (си, табл. 5) .

Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению, в кювете 2 0,00573 аскорбата снижает теоретическую величину на 35%, в кювете 3 это нарушение полностью устраняется добавкой

О,ООЗЪ аскорбатоксндазы.

Пример 7. Определение нирокатехина с SNBTH и дифенол-оксидаэой(см. табл. 6) .

Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению, В кювете 20,011453 аскорбата снижают теоретическую величину на 47%, это нарушение полностью устраняется в кювете 3 добавкой 0,0003% аскорбатоксидаэы.

Полученный способ позволяет полностью устранить вызванные ошибки наличием аскорбиновой кислоты при проведении окислительно-восстановительных реакций.

797592

Продолжение табл. 1 вета

Компоненты

Раствор глюкозы, 0,172%

0,03 0,03

0,03

О „03 0,03

Раствор аскорбиновой кислоты

0,1 0,01

0,1 Оф01

0,02 0,11 вЂ” . 0,09

0,12

Вода

0,02 . 0,02

Аскорбатоксидаза

500 ед./мл, 0,054

Инкубация 1 мин при 25оС, считывание Е, затем начинается реакция с

G0D О,ОЗЗЗЪ

0,1 0,1 0,1 0,1

Инкубация 30 мин при 25оС,считывание Е .,вычисление из Е -Е =6E

0,541 0,010 0,31б 0,540 0,543

ДЕ

Таблица 2

Фосфатный буферный раствор, рН 5,6 1,3609%

2,75

0,05

0 05

0,02

0,1

Раствор аскорбиновой кислоты, 1 ммоль

0,1 0,01 0,1 0,01

0,02 0,11 вЂ” 0,09

0,12

0,02 0,02

Инкубация 1 мин при 25 C,ñ÷èòûâàíèå Е, начало реакции с

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

600 0,0333%

Инкубация 30 мин при 25оС считывание Е, вычисление из Е -Е, = д Е

0,505 0,000 0,40 0,502 0,504

ABTS 2,74%

POD, 0,25%

Раствор глюкозы, 0,0172%

Вода

Аскорбатоксидата,005%

0,05

0,02

2,75 2,75

0,05 0,05

0,02 О 02

79Уг 9) Т а с и и ii 3

Компо

Кюветд

Фосфатный буферный раствор, рН 7,5, 1,36%

1,7

0,1

0,01 0,01

Аскорбатоксидаза, 0,00035%

0,03

0,04

0,03

Вода

Инкубация 3 мин при 25 С, считывание Е на ало реакции с

НК/G6P-DH-раствор по 0,14%

0,05 0,05 0,05

Ннкубация 15 мин, считывание Е, вычисление из E -E> = Ь E

0,234 0,307 0,230 Таблица 4

Фосфатный буферный раствор рН 5,6, 0,14%

1,30

1,20 1,29

0,1

0,01

Инкубация 3 мин при 25ОС, затем раствор набирается пипеткой в отдельные кюветы

3,7

TRA

1,0

0,68

NA0-раствор 0,5

Р ас твор ди афор азы О, 2

0,2

0,05

0 05

0,05

О, 0. i

0,05

0,8 с он

NADP INT по 0,1%

Диафораза 5 E/ìë, 0,1%

Раствор глюкозы, 0,005%

Раствор аскорбата 0,17%

Раствор глутамата, 0,02%

Раствор аскорбата, 0,086%

Аскорбатоксидаза, 0,01%

Калийфосфатный буферный раствор рН 8,6 с 1,5%. тритона-Х-100

1,18 1,27

0,1 0,1

0,1 0,01

0,02 0,02

1,0 1,0

0,2 0,2

0,05 0,05

797592

Продолжение табл. 4

Кювета

Компоненты

Считывание Е, начало реакции с

0,05 0,05 0,05

1 Т вЂ” раствор 0,2

0,05

Инкубация 15 мин при 25 С, считывание Е вычисление из Е -Z, = d Е о

Таблица 5

Фосфатный буферный, раствор рН 5,2, 3,44

2,77

0,05

SMBTH 0,1 мол, за

Раствор аскорбиновой кислоты, 0,172%

0,1

0 1

0,02

Вода

Аскорбатоксидаза

500 Е/мл 0,05%

0,02

0,05

Тироэиназа, 0,2

Инкубация 1 мин при 25ОС считывание Е>, начало реакции с

0,036% тирозин

0 05 0,05 0,05

Инкубация 1 час при 25ОС считывание Е, вычисление из Е>-E„ = AE

1t113 0,728 1,100

ЬЕ

Т а б л и ц а 6.

Фосфорный буферный раствор, рН 5 2, 3,4%

2,68

2,70.2,80

0,05

0i05

0,10

0,1, 0 i 3.

0,02

SMBTE1 0,1, З,ОЪ .

Пирокатехин, 0,0056%

Раствор аскорбата 20 ммоль

Аскорбатоксидаза 500 Е/мл

0 184 1г560 0ñ 380 Ог186 О ° 182

В! . 4Г". а °:- ° ° t з

° Е ЕР,Е 9» "Е Ре, ь. р р" "" " " 1675 92

Продолжение табл. >

Кювета

Компоненты

Инкубация 1 мин при 25 СР считывание Е, начало реакции с дефенолоксидаэа, 0,23 0,05 0,05 0 05

Инкубация 17 мин при 25 С считывание Е, вычисление из Е -Е = ЬЕ

IR 1

ЬЕ

0,890 0,485 Г,896

Формула изобретения

Составитель Морозова

T д . сталош Ко екто И. Муска

Редактор

Заказ 982

539 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Ра сная наб., д. 4 5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1 ° Способ определения субстрата или ферментативной активности в биологическом материале путем проведения окислительно-восстановительной реакции, отличающийся тем,что, с целью повышения точности способа, в реакционную смесь вносят аскорбатоксидаэу в количестве

100 Eg/ìë исходной смеси, а учет реакции ведут по образованию окрашенного продукта.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что для получения окрашенного продукта аскорбатоксидазу вводят одновременно с Н Оаобразукщим ферментом.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что для получения окрашенного продукта аскорбатоксн2О даэу вводят одновременно с солью тетразолия.

4. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что для получения окрашенного продукта аскорбатоксидаэу вводят одновременно с фенолом.

5. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что используют аскорбатоксидазу иэ zucchini (Cucurbuta

pepo medullos.à).

30, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. В !ochemiса1 Сорреr Рroceedings

Иагкi292en И.Ч. 1965, с. 305-337.