Способ получения рибонуклеазы

Способ получения рибонуклеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОР@К©МУ СВИ ИИЛЬСТВУ

O" (6т) Дополнительное к авт. свкд-ву (22) Заявлено 270379 (21) 2742091/28-13 (53)M. КЛ.

С 12 D 13/10 с присоединением заявки Мо

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н открытий (23) Приоритет (53) УДК 663.15 (088.83

Опубликовано 230) 81. Бюллете

Дата опубликования описания 230181 (72) Авторы изобретения

Э.-В.В.Башкис, О.B.Kèñëóõèíà и Т.A,Êóçíåöîâà (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (543 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕАЗЫ

Изобретение относится к микробио-. логической промышленности, а именно к способу получения рибонуклеазы.

Известен способ получения рибонуклеазы, предусматривающий культивирование ее продуцента †. бактерий вида

Bacillus ьоЫЖз на питательной среде, содержащей источники азота, еосфора,. минеральные соли и крахмал. . в качестве источника углерода 53 °

Недостатками известного способа являются низкая активность фермента и большая продолжительность процесса культивирования.

Цель изобретения — повышение ак- 15 тивности фермента и сокращение времени культивирования.

Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента рибонуклеазы иэ вида Bacillus воЬМВИ ис- 26 пользуют штамм Вос1Иов эцМ16тв

ЦМПМ В - 1611. При этом культивирование продуцента осуществляют на пита тельной среде следующего состава, г/л: 25

Крахмал картофельный осахаренный 100-140

Гидролнэат микробной биомассы 13- 17

КСс или Кх50а 0,27-0,33 ъ 9О4 0,009-0,01 1

Вода . Остальное.

Штамм Bacillus subt tis ЦМПМ В

1611 хранится в коллекции культур

ВНИИ генетики и селекции,Промышленных микроорганизмов.

Характеристика штамма.

Культурально-морфологические приз наки.

На сусло-мясо-пептонном агаре колонии довольно крупные, до 15 мм в диаметре, сухие,кожистые,морщинистые, края колоний сильно изрезаны, поверхность колонии покрыта серовато" белым налетом, в агар колонии не врастают. На картофельном агаре пленка культуры тоньше и сильно врастает в агар. На ломтиках картофеля культура образует мощную пленку серого цвета, сильно складчатую. Выделяет значительное количество бурого пигмеи та, в ломти картофеля врастает слабо. Пузырьков со слизью нет. На пшеничных отрубях культура дает очень богатый рост в виде шаровидных серовато-белых скоплений по всей толщине среды. На глюкозном агаре культура растет по всему уколу с образованием газа.

798165

Клетки поверхностной культуры соединены н длинные филаменты, при глу-. бинном культивировании нстречаются как одиночные клетки, так и соединенные попарно или по четыре. Размер клеток: диаметр 0,6-0,7у.,длина 1,53 5лс . Диаметр спор не превышает диI аметра клетки, споры расположены эксцентрально, но ближе к центру, чем .резко отличаются от спо1З многих других штаммов того же вида, имеющих нид спичечной головки . физиолого-биохимические свойства.

Молоко пептонизирует без подкисления. Желатину разжижает. Казеин и крахмал гидролизует.

Отношение к углеводам: арабинозу, 15 галактозу, клюкоэу, ксилозу,рамнозу, дульцит, маннит, сорбит, мальтоэу, лактозу, сахароэу, декстрины, крахмал ассимилирует без предпочтения.

Нитраты восстанавливает. 20

На среде Кларка образует ацетилметилкарбинол.

Хорошо растет при 25-42 С, оптимальная температура роста 37 С.

Культура является аэробом, в отсутствии кислорода подвергается анаэробному лизису .

При глубинном культивировании на питательных средах, содержащих органические источники углерода, азота и минеральные соли, штамм синтеэи- ЗО рует следующие ферменты: комплекс бактериолитических ферментов, глюканазу, маннаназу, хитинаэу, нейтральную протеазу, РНКазу, d Ñ-амилазу, каталаэу. 35

Пример 1. 120 г картофельного крахмала,суспендируют н 500 мл водопроводной воды, добавляют 0,2 г амилосубтидина ГЗХ и нагревают взвесь при постоянном перемешивании до 80 С, 4g периодически проверяя реакцию крахмала с йодом. Осахаривание заканчивают по достижении красно-коричневой окраски.

В 500 мл водопроводной воды растворяют 0,3 г калия сернокислого и

0,01 r сернокислого цинка, добавляют 15 r сухого ферментативного гидролизата биомассы метанокисляющих бактерий тщательно размешивают полу- Я} ченную взвесь, затем добавляют раствор осахаренного крахмала, вновь перемешивают среду и устанавливают рН 6,8 с помощью 10% раствора 11аОН.

Питательную среду разливают по 100мл в колбы емкостью 750 мл и стерилизуют в течение часа при давлении 0,5ат, После охлаждения среду засевают водной суспензией поверхностной культуры В. зоЖЮ1з В-1611, выращенной на ломтях картофеля в течение суток 60 при 37 С.

Колбы с засеянной средой инкубируют на качалке при 37 С в течение 20ч.

По окончании инкубации рН культуральной жидкости 4,6 активность рН 65

Казы 5200 ед/мл. Активность фермента сохранялась в течение 10 дней при хранении культуральной жидкости при температуре 5 С.

Пример 2 ..В чан,оборудован. ный мешалкой и водяной рубашкой, наливают 75 л водопроводной воды и при перемешивании добавляют 18 кг картофельного крахмала и 60 г амилосубтилина F3X. Суспензию крахмала нагревают при перемешинании до 75ОС и выдерживают при этой температуре

10 мин до момента перехода крахмала в эритродекстрины. Раствор осахаренного крахмала передают в ферментер емкостью 250 мл вносят 0,2 л подсолнечного масла н качестве пеногасителя и стерилиэуют компонент 30 1лин при 135 С.

В чан с мешалкой наливают 45 л но. допроводной воды, вносят 2 кг сухого ферментативного гидролизата БВК, 0,045 кг КСВ и 0,0015 кг сернокислого цинка, тщательно размешивают взвесь и передают н сателлит ферментера. (Стерилиэуют 30 мин при 135 С.

После охлаждения до 60 С содержимое сателлита передают и ферментер, средУ охлаждают до температ фы 40 С, устанавливают рН 7 с помощью нодного аммиака.

Питательную среду засеваМи водной суспензией культуры 8.9UQK E S В-1611, выращенной в колбе на пшеничных отрубях в течение 2 сут при 37 С.

Выращивание в ферментере проводят при 37 3 1ОС, постоянном перемешинании и аэрации 8-10 м /ч, продолжительность выращивания 18 ч. В процессе выращивания рН культуральной жидкости не регулируют. По окончании процесса рН культуральной жидкости составляет 4,3, активность рН Казы

6800 ед/мл, объем культуральной жидкости 150 л. Активность рН Казы в культуральной жидкости оставалась постоянной в течение 7 дней при 5100С

Предлагаемый способ получения рибонуклеазы позволяет увеличить активность

Ф фермента в культуральной жидкости до 5200-6800 ед/мл, что в 3 раза выше по,сравнению с известным способом при одновременном сокращении продолжительности выращивания продуцента.

Формула изобретения

1, Способ получения рибонуклеазы., предусматривающий культивирование ее продуцента — бактерий вида S а с i 1 1 u s

50ЪЫ с1Ъ на питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и крахмал в качестве источника углерода, о т л и ч а юшийся тем,что,с целью повышения активности фермента и сокращения времени культивирования,в качестве продуцента рибонуклеазы ° иэ нида ВаС В798165

Составитель T. Мелентьева

Редактор Т.Киселева Техред T. Наточка Корректор М.немчик

Подписное

Закаэ 9949/30 . Тираж 539

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам иэобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент . r. Ужхавод, ул. Проектная, 4

ЬЬ Subtitle испольэуют штамм BacitKus subtsP.as Цмпм В-1611.

2. Способ по и. l, о тли ч аюшийся тем, что культивирование продуцента осуществляют на питательной среде следующего состава, г/л:

Крахмал картофельный осахаренный 100-140

Гидролизат микробной биомассы 13-17

КСЯ или К 60 О, 27-0, 33

2и 604 0,009-0,011

Вода Остальное

Источники информации, 5 принятые во внимание при экспертиэе

1. Nishilnuea s. Вас Ибв вцЪОбы..1ЪоnucLease "Ргосеейпув in uceeic acid eБесн сИ" New 1о М-ьondon,496ь 5ь-63.